Coculturazione dei neuroni gangliari retinici con glia inguainante olfattiva

Abstract

Fonte: Portela-Lomba, M., et al. Cocoltura di neuroni gangliari retinici di ratto assotomizzati con glia inguaina olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assonale adulta. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la procedura per isolare i neuroni gangliari retinici (RGN) dalla retina di un ratto e cocoltivarli con cellule gliali che inguainano l'olfatto. Questo metodo consente di studiare il potenziale neuro-rigenerativo degli OEG dopo una lesione neurale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione di ihOEG (Ts12 e Ts14) per il test

NOTA: Questo passaggio deve essere fatto 24 ore prima della dissezione e della cocoltura RGN.

1. Trattare vetrini coprioggetti da 12 mm Ø con 10 μg/mL di poli-L-lisina (PLL) per 1 h.
   nota: I vetrini coprioggetti possono essere lasciati per una notte nella soluzione PLL.
2. Lavare i vetrini coprioggetti con 1 tampone fosfato salino (PBS) tre volte.
3. Staccare le cellule ihOEG Ts12 e Ts14 dalla piastra di coltura cellulare p60.
   1. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura DMEM/F12 (terreno basale)-FBS (siero fetale bovino) a una provetta conica da 15 mL. Scaldare a 37 °C in un bagno d'acqua pulita.
   2. Rimuovere il terreno dalle piastre e lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)-EDTA (acido etilendiammina tetraacetico) una volta.
   3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA alle cellule OEG e incubare per 3-5 minuti a 37 °C, 5% di CO₂.
   4. Raccogliere le cellule con una pipetta p1000 e trasferirle nel terreno preparato al punto 2.1.
   5. Centrifugare per 5 min a 200 x g.
   6. Aspira al surnatante.
   7. Aggiungere 1 mL di terreno ME10 e risospendere il pellet.
   8. Contare il numero di cellule in un emocitometro.
4. Seminare 80.000 cellule Ts14 o 100.000 cellule/pozzetto sui vetrini coprioggetti in piastre a 24 pozzetti in 500 μL di terreno ME10.
5. Colture di cellule a 37 °C in 5% CO₂ per 24 ore.

2. Dissezione del tessuto retinico

NOTA: I ratti Wistar maschi di 2 mesi sono usati come fonte RGN. Due retine (un ratto) per 20 pozzetti di una capsula cellulare da 24 pozzetti. Autoclavare il materiale chirurgico prima dell'uso. Il kit per la dissociazione della papaina viene acquistato in commercio (Tabella dei materiali). Seguire le istruzioni del fornitore per la ricostituzione. Ricostituire l'acido D, L-2-ammino-5-fosfonovalerico (APV) in 5 mM e preparare le aliquote.

1. Il giorno del test, preparare i seguenti terreni.
   1. Preparare una piastra per colture cellulari p60 con 5 ml di EBSS freddo (soluzione salina bilanciata di Earle) (fiala 1 del kit di dissociazione della papaina).
   2. Preparare una piastra per colture cellulari p60 con la fiala ricostituita 2 (papaina) del kit di dissociazione della papaina più 50 μl di APV. Quindi, aggiungere 250 μl di flaconcino 3 ricostituito (DNasi più 5 μl di APV).
   3. In una provetta sterile, mescolare 2,7 mL di flaconcino 1 con 300 μL di flaconcino 4 (inibitore dell'albumina-ovomucoide proteasi). Aggiungere 150 μL di flaconcino 3 (DNasi) più 30 μL di APV.
   4. Preparare 20 mL di terreno Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Sacrifica un topo per asfissia con CO₂.
3. Rimuovere la testa per decapitazione con una ghigliottina; metterla in una capsula di Petri da 100 mm e spruzzare la testa con etanolo al 70% prima di metterla in una cappa a flusso laminare.
4. Taglia i baffi del topo con le forbici in modo che non interferiscano con la manipolazione degli occhi.
5. Afferra il nervo ottico con una pinza per estrarre il bulbo oculare abbastanza da poter praticare un'incisione attraverso l'occhio con un bisturi.
6. Rimuovere il cristallino e l'umor vitreo ed estrarre la retina (tessuto simile all'arancia) mentre gli strati rimanenti dell'occhio (compreso lo strato epiteliale pigmentato) rimangono all'interno.
7. Posizionare la retina nella piastra di coltura cellulare p60 preparata al punto 2.1.1.
8. Trasferire la retina nella piastra di coltura cellulare p60 preparata al punto 2.1.2 e tagliarla con il bisturi in piccoli pezzi di dimensioni approssimative < 1 mm.
9. Trasferire in una provetta di plastica da 15 mL.
10. Incubare il tessuto per 30 minuti, in un'incubatrice umidificata a 37 °C sotto il 5% di CO₂, con agitazione ogni 10 minuti.
11. Dissociare i grumi cellulari pipettandoli su e giù con una pipetta di vetro Pasteur.
12. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min.
13. Scartare il surnatante. Per inattivare la papaina, risospendere il pellet cellulare nella soluzione preparata al punto 2.1.3 (1,5 mL per 2 occhi).
14. Pipettare con cautela questa sospensione cellulare in 5 mL di flaconcino ricostituito 4.
15. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
16. Durante la centrifugazione, rimuovere completamente il terreno ME-10 dalla piastra cellulare OEG a 24 pozzetti (precedentemente preparata nella fase 1) e sostituirlo con 500 μl di terreno NB-B27 per pozzetto.
17. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di terreno NB-B27.
18. Piastra 100 μL di sospensione di cellule retiniche, per pozzetto della piastra m24, su vetrini coprioggetti trattati con PLL o monostrati OEG.
19. Mantenere le colture a 37 °C con il 5% di CO₂ per 96 ore in terreno NB-B27.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supplemento B-27	Gibco	17504044
Acido D,L-2-ammino-5-fosfonovalerico	sigma	283967	inibitore del recettore NMDA
DMEM-F12	Gibco	11320033	Terreno di coltura cellulare
FBS	Gibco	11573397	Siero fetale bovino
FBS-Hyclone	Fisher Scientifico	16291082	Siero fetale bovino
L-Glutammina	Lonza	BE17-605F
Terreno neurobasale	Gibco	21103049	Terreno di coltura di cellule neuronali
Sistema di dissociazione della papaina	Società biochimica Worthington	LK003150	Per l'uso nell'isolamento delle cellule neurali
Pbs	Fatto in casa
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Penicillina/Streptomicina/Amfotericina B	Lonza	17-745E	Batteriostatico e battericida
Estratto ipofisario	Gibco	13028014	Estratto ipofisario bovino
Poli-L-lisina (PLL)	sigma	A-003-M