Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Macchie di gel della matrice extracellulare
- Eseguire i seguenti passaggi un giorno prima dell'isolamento:
- Scongelare un'aliquota di gel di matrice extracellulare (100 μl) a 4 °C per almeno 1,5 ore. Diluire 1:10 nel terreno di Eagle's modificato di Dulbecco; con 4.500 mg/L di glucosio, 4 mM di L-glutammina e 110 mg/ml di piruvato di sodio (DMEM). Mantenere il gel della matrice extracellulare a 4 °C in ogni momento.
NOTA: Sbalzi di temperatura improvvisi provocheranno un rivestimento irregolare e la formazione di cristalli.
- Mantenere la soluzione gel diluita della matrice extracellulare sul ghiaccio per 15 minuti.
- Pre-raffreddare una micropipetta da 20 μl per 10 minuti.
- Inserire i vetrini della camera a 8 pozzetti in una piastra di Petri da 100 mm e trasferire la piastra su una superficie fredda (ad es. una confezione per congelatore) per 10 minuti.
- Utilizzare la micropipetta pre-raffreddata per inserire una goccia di 10 μl di gel per matrice extracellulare in ciascun pozzetto. Tenere la capsula di Petri sulla superficie fredda per almeno altri 7 minuti (Figura 1A).
- Rimuovere completamente il gel della matrice extracellulare rimanente (Figura 1B) e asciugare i pozzetti a 37 °C per una notte.
2. Dissezione dei muscoli della testa (massetere, digastrico e elevatore Veli Palatini)
- Prima della dissezione, preparare 50 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con il 2% di penicillina-streptomicina (P/S). Mantenere il ghiaccio.
- Dopo l'eutanasia di un giovane ratto adulto (9 settimane) con CO2/O2, decapitare la testa e rimuovere la pelle dalla testa. Trasferire la testa in PBS ghiacciato integrato con il 2% di P/S in un tubo da 50 ml.
- Muscolo massetere (derivato dal 1° arco branchiale)
- Posizionare la testa con un lato rivolto verso l'alto su un cuscinetto di silicone e fissarla con aghi ipodermici (Figura 2A).
- Identificare la ghiandola parotide e il nervo facciale (Figura 2A). Esporre la fascia profonda che copre la ghiandola. Tagliare la fascia e rimuovere la ghiandola usando le forbici da dissezione. Identificare il canale uditivo esterno. Tracciare il nervo facciale dal forame stilomastoideo e rimuovere con cura i rami temporale, zigomatico e buccale con una lama di bisturi n. 15.
- Liberare la testa superficiale del muscolo massetere rimuovendo la fascia. Identificare sia le teste superficiali che quelle profonde del muscolo massetere. Tracciare la testa superficiale fino a quando la sua spessa aponeurosi tendinea non si inserisce nel processo zigomatico della mascella.
- Separare il tendine dalla sua origine durante il processo zigomatico con una pinza diritta. Tagliarlo con una lama di bisturi n. 15 o con delle forbici da dissezione e sollevarlo con cautela (Figura 2B).
- Sezionare la testa superficiale del massetere fino al suo inserimento all'angolo e alla metà inferiore della superficie laterale del ramo della mandibola con una lama di bisturi n. 15 (Figura 2C). Ora, rimuovi completamente il muscolo.
- Pancia posteriore del muscolo digastrico (derivato dal 2° arco branchiale)
- Posizionare la testa in posizione supina sul cuscinetto in silicone e fissarla con aghi ipodermici (Figura 3A).
- Rimuovere il grasso sottocutaneo sovrastante sia la ghiandola sublinguale che quella sottomandibolare. Successivamente, rimuovere la fascia superficiale e le ghiandole utilizzando le forbici da dissezione. Esporre il muscolo digastrico (ventre anteriore e posteriore).
- Tenere il tendine anteriore del ventre posteriore con una pinza dritta, tagliarlo e sezionarlo con cura fino a quando la sua origine non è nella bolla timpanica (Figura 3B). Fai lo stesso sul lato controlaterale.
- Muscolo elevatore veli palatini (derivato dal 4° arco branchiale)
- Dopo la dissezione del ventre posteriore del muscolo digastrico, localizzare il muscolo stiloioideo, tirarlo lateralmente e rimuoverlo con cura (Figura 4A).
- Localizzare il tendine dell'elevatore dei veli palatini che si inserisce in corrispondenza della bolla timpanica (Figura 4A). Sezionalo con cura e taglialo su entrambi i lati.
- Cerca la trachea e l'esofago che corre dietro di essa. Sollevare l'esofago ed esporre la faringe e la laringe.
- Localizzare e sezionare l'area del muscolo costrittore faringeo superiore. Identificare l'elevatore veli palatini e tagliarlo da entrambi i lati (Figura 4B).
nota: Subito dopo la dissezione, rimuovere con cura il tendine e il tessuto connettivo da ciascun muscolo sotto lo stereomicroscopio. Immergere rapidamente tutti i campioni in etanolo al 70% e trasferirli in PBS ghiacciato integrato con il 2% di P/S in un tubo da 15 ml.
3. Isolamento delle Celle Satelliti (SC)
- Eseguire le seguenti fasi di preparazione per l'isolamento SC dai tre gruppi muscolari:
- Preparare 7,5 ml di pronasi allo 0,1% in DMEM. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. Preriscaldare la soluzione a 37 °C a bagnomaria per 10 minuti prima dell'isolamento.
- Preparare 35 ml di DMEM integrati con il 10% di siero di cavallo (HS) e l'1% di P/S. Inoltre, preriscaldare a 37 °C a bagnomaria.
- Preparare 15 ml di terreno di coltura costituito da DMEM integrato con il 20% di siero fetale bovino (FBS), il 10% di HS, l'1% di P/S e l'1% di estratto di embrione di pollo (CEE). Preriscaldare a 37 °C a bagnomaria.
- Pre-rivestire sei pipette di plastica (10 ml) con HS e asciugare per almeno 10 minuti prima dell'uso.
- Nella cappa di coltura, trasferire ogni muscolo in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Utilizzando le forbici da dissezione, tagliare il muscolo in piccoli pezzi di circa 2 mm. Fare attenzione a non tritare troppo il fazzoletto.
- Aggiungere con cautela 2,5 ml di soluzione di pronasi allo 0,1% in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 60 minuti. Agitare delicatamente la piastra dopo 20, 40 e 60 minuti
nota: La durata esatta dell'incubazione dipende da fattori come l'età e il ceppo degli animali.
- Monitorare al microscopio. Controllare i frammenti muscolari e interrompere la digestione enzimatica quando i fasci di fibre appaiono allentati (Figura 5).
- Aggiungere 2,5 ml di DMEM addizionato con il 10% di HS e l'1% di P/S. Trasferire in una provetta da 15 ml e centrifugare le provette a 400 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante per decantazione.
- Aggiungere 5 ml di DMEM addizionato con il 10% di HS e l'1% di P/S. Pipettare la soluzione su e giù con una pipetta di plastica da 10 ml (triturazione) almeno 20 volte per omogeneizzare il tessuto.
- Centrifugare le provette a 200 x g per 4 min. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una provetta da 15 ml.
- Aggiungere 5 ml di DMEM integrati con il 10% di HS e l'1% di P/S. Pipettare nuovamente con una pipetta di plastica da 10 ml fino a quando i frammenti di tessuto non passano facilmente.
- Centrifugare le provette a 200 x g per 4 minuti e raccogliere il surnatante in una provetta da 15 ml.
- Mettere un colino cellulare (40 μm) su una provetta da 50 ml e trasferire il surnatante contenente le cellule dissociate sul filtro. Lavare con 1 ml di DMEM per il massimo recupero cellulare.
- Centrifugare le provette a 1.000 x g per 10 minuti e scartare il surnatante con una pipetta.
- Risospendere il pellet in un terreno di coltura da 300 μl e contare le cellule in un emocitometro.
4. Differenziazione di cellule satelliti su macchie di gel di matrice extracellulare
- Diluire la sospensione cellulare per ottenere 1,5 x 103 cellule in 10 μl di terreno di coltura.
- Fissare i coperchi dei vetrini della camera con del nastro adesivo e contrassegnare i punti con un pennarello nero sul lato inferiore del vetro dell'oggetto.
- Utilizzando una micropipetta, versare una goccia di 10 μl di sospensione cellulare sul punto di gel della matrice extracellulare. Controllare al microscopio se la goccia di sospensione cellulare è stata posizionata correttamente sul posto. Incubare per sei ore a 37 °C.
- Aggiungere con cautela 400 μl di terreno di coltura (DMEM integrato con 20% FBS, 10% HS, 1% P/S e 1% CEE) e incubare per tre giorni a 37 °C.
nota: A questo punto, le SC appena isolate sono sottoposte a un trauma massivo (digestione enzimatica e dura triturazione) e devono riprendersi. Non disturbare le celle durante i primi tre giorni. Successivamente, il terreno di coltura può essere modificato a seconda del tipo di esperimento.
Gli spot di gel della matrice extracellulare possono essere seminati con un'alta densità cellulare (1,5-2,5 x 103/20 μl) per il saggio di differenziazione. Il terreno di coltura (DMEM integrato con il 20% di FBS, il 10% di HS, l'1% di P/S e l'1% di estratto di embrioni di pollo) può essere sostituito ogni tre giorni.
