Neurogenesi indotta da acido retinoico utilizzando cellule di carcinoma embrionale di topo

Abstract

Fonte: Leszczyński, P., et al., Neurogenesi utilizzando cellule di carcinoma embrionale P19 J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra una semplice tecnica per la neurogenesi indotta dall'acido retinoico in cellule di carcinoma embrionale di topo P19. L'acido retinoico attiva i fattori di trascrizione e innesca l'espressione genica per la differenziazione neuronale.

Protocollo

1. Generazione aggregata

1. Aggiungere 5 μL di RA (acido retinoico) (1 mM di brodo disciolto in etanolo al 99,8%, conservato a -20 °C) ai 10 mL di terreno di differenziazione e mescolare bene (concentrazione finale di 0,5 μM RA).
   nota: L'artrite reumatoide è sensibile alla luce. Una bassa concentrazione di etanolo non influisce sulla differenziazione cellulare.
2. Aggiungere 10 mL di terreno di differenziazione (con AR) al piatto di coltura non trattato da 100 mm (dedicato alla coltura in sospensione).
3. Seminare le⁶ celle 1 x 10 nel piatto da 100 mm (superficie del piatto 56,5 cm2).
4. Mettere il matraccio con le cellule nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per 2 giorni per favorire la formazione dell'aggregato.
5. Dopo 2 giorni, sostituire il mezzo di differenziazione. Aspirare il terreno contenente aggregati utilizzando una pipetta da 10 mL e trasferirlo in una provetta da 15 mL a RT.
6. Lasciare che gli aggregati si depositino per gravità per 1,5 minuti a RT.
7. Scartare il surnatante.
8. Aggiungere 10 mL di terreno di differenziazione fresco con 0,5 μM di AR utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
   cautela: Non pipettare gli aggregati cellulari su e giù.
9. Seminare gli aggregati in una nuova piastra di coltura non trattata da 100 mm (dedicata alla coltura in sospensione).
10. Porre la piastra nell'incubatore (a 37 °C e 5% di CO₂) per 2 giorni.

2. Dissociazione aggregata

1. Aspirare gli aggregati cellulari utilizzando una pipetta da 10 mL.
2. Trasferire gli aggregati in una provetta da 15 mL. Lasciare che gli aggregati cellulari si depositino per gravità per 1,5 minuti.
3. Rimuovere il surnatante.
4. Lavare gli aggregati con il solo DMEM (senza siero e antibiotici).
5. Lasciare sedimentare gli aggregati cellulari per sedimentazione per gravità per 1,5 minuti a RT.
6. Aspirare il surnatante e aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA (0,25%).
7. Mettere gli aggregati cellulari a bagnomaria (37 °C) per 10 minuti. Agitare delicatamente gli aggregati ogni 2 minuti picchiettando con una mano.
8. Arrestare il processo di tripsinizzazione aggiungendo 4 ml di terreno di manutenzione.
9. Pipettare gli aggregati su e giù 20 volte utilizzando una pipetta da 1 mL.
10. Centrifugare le celle per 5 minuti a 200 x g e RT.
11. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di mantenimento.
12. Determinare il numero di cella con un contatore di celle.

3. Celle di placcatura

1. Aggiungere 3 mL per pozzetto di terreno di mantenimento a una piastra a 6 pozzetti.
2. Seminare le cellule nella piastra di coltura a 6 pozzetti a una densità di 0,5 x 10⁶/pozzetto.
3. Incubare a 37 °C con una concentrazione di CO₂ del 5%.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM alto glucosio (4,5 g/L) con L-glutammina	Lonza	BE12-604Q
Etanolo 99,8%	Chempur	CHEM*613964202
Siero fetale bovino (FBS)	EURx	E5050-03
Penicillina/Streptomicina 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x concentrata senza ioni calcio e magnesio	Lonza	BE17- 517Q
Acido retinoico	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	Disciolto in etanolo al 99,8%; conservare a -20 °C fino a 6 mesi
Tripsina 0,25% - EDTA in HBSS, senza ioni calcio e magnesio, con Rosso Fenolo	Biosieri	Pannello LM-T1720/500
Pipette sierologiche da 1 mL	Profilab	515,01
Pipette sierologiche da 10 mL	Profilab	515,1
Piatto da 100 mm dedicato alla coltura in sospensione	Corning	C351029
Provette da centrifuga da 15 mL	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
Pipette sierologiche da 5 mL	Profilab	515,05
Piastra a 6 pozzetti	Corning	CLS3516
Palloni per colture cellulari, superficie 25 cm quadrati	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA