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1. Coltura di fibroblasti embrionali di topo (MEF)
- Preparare il MEF medium, il medium Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM, high-glucose), integrato con il 15% di siero fetale bovino (FBS).
- Rivestire piastre di coltura cellulare da 100 mm con una soluzione di gelatina allo 0,5% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Contare i MEF utilizzando un citometro. Togliere la soluzione di gelatina e versare immediatamente il terreno MEF preriscaldato a 37 °C. Scongelare rapidamente i flaconcini di MEF trattati con mitomicina C in un bagnomaria a 37 °C per 2 minuti, quindi seminare 2,8 x 106 MEF per piatto gelatinoso da 100 mm. Regolare il numero di cellulare di conseguenza se si utilizzano piatti di altre dimensioni. Incubare i MEF per una notte a 37 °C, 5% CO2.
- Cambia il mezzo il giorno successivo. Coltura per 2-3 giorni fino a quando il livello MEF non è confluente.
2. Cellule staminali embrionali di topo o coltura ESC
- Preparare il terreno ESC, il terreno di Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove integrato con il 15% di FBS e 103 U/mL di fattore inibitorio della leucemia (LIF), 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 55 mM di 2-mercaptoetanolo, penicillina (100 U/mL), streptomicina (100 μg/mL), gentamicina (200 μg/mL) e 0,2% di antibiotico micoplasma.
- Togliere il terreno MEF dal piatto preparato al punto 1 e sostituirlo con un terreno ESC preriscaldato a 37 °C.
- Scongelare una fiala di ESC e seminare le cellule sopra lo strato di MEF. Incubare a 37 °C, 5% CO2, fino a quando le ESC raggiungono la confluenza.
- Preparare nuovi piatti per colture cellulari contenenti un monostrato confluente di MEF. Per far passare gli ESC, lavare una volta con PBS e staccare con tripsina/EDTA allo 0,25% per 2-5 minuti a 37 °C, 5% CO2. Arrestare la tripsinizzazione aggiungendo un nuovo IMDM con il 15% di FBS alle cellule che si staccano, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare a 160 x g per 5 minuti a RT.
- Rimuovere il surnatante, risospendere le ESC con IMDM fresco e far passare un quinto delle cellule in ogni nuovo piatto rivestito di MEF; incubare fino a quando le cellule raggiungono la confluenza (in genere 4-5 giorni).
3. Ritira MEF e ESC di coltura su piastre rivestite di gelatina
- Una volta che gli ECS raggiungono la confluenza, staccarli e i MEF con tripsina/EDTA allo 0,25% come nel passaggio 2.4, risospendere le cellule in IMDM fresco, trasferirle in una capsula di Petri batteriologica non adesiva e incubare per 40 minuti a 37 °C, 5% CO2.
- Trasferire con cura le ESC e il terreno contenente MEF in una nuova piastra rivestita di gelatina utilizzando una pipetta da 5 ml, evitando di ripetere il pipettaggio. Le cellule che rimangono nelle piastre di Petri sono MEF poiché le ESC non aderiscono.
- Passaggio dei CES ogni 3-4 giorni. Un passaggio meno frequente può ridurre la pluripotenza delle ESC. Non superare il 60% di confluenza, in quanto potrebbe favorire la differenziazione.
- Ripetere i passaggi 3.2-3.3 tre volte o più, a seconda delle necessità, fino a quando i MEF non sono più rilevabili da un microscopio per colture cellulari, utilizzando un obiettivo 20X, per assicurarsi che i MEF non siano presenti.
- Verificare la pluripotenza delle ESC controllando la coltura delle ESC per vedere se le cellule formano colonie dense con la tipica morfologia poligonale delle ESC (Figura 1A). Testare la staminalità cellulare mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi trascrittasi inversa (qRT-PCR), immunoblotting o immunofluorescenza dei principali fattori di trascrizione della pluripotenza (Figura 2).
4. Formazione EB
- Preparare una soluzione madre all-trans-RA a 10 mM in DMSO e aliquotarla in provette per microfughe protette dalla luce da 1,5 mL. La soluzione è stabile a -80 °C per un massimo di due settimane. Proteggilo dalla luce.
- Tripsinizzare le ESC come al punto 2.4; riplaccare in IMDM fresco senza LIF come sospensione a cellula singola.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare una sospensione 5 x 105 cellule/mL in IMDM con 0,5 μM di RA.
- Piastra 100 gocce da 20 μl per piastra di Petri da 100 mm con una pipetta a 8 canali e puntali da 200 μl, capovolgi le piastre e riempi il coperchio capovolto con PBS per evitare che le gocce pendenti si secchino. Proteggere i terreni di coltura contenenti AR dalla luce.
- Coltura di EB in gocce sospese a 37 °C, 5% CO2, per 4 giorni.
