1. Clonazione di 2K7 Lentivector
- Prima di clonare il gene di interesse nel vettore lentivirale 2K7, subclonare il gene nel vettore pENTR (3637 bp, Kanamicina resistente) utilizzando tecniche molecolari standard. Utilizzare i siti di restrizione EcoRI e SacII per il subclonaggio.
- Amplificazione del lentivettore 2K7
- Trasformare il DNA lentivettore 2K7 mescolando delicatamente 100 ng di DNA plasmidico con cellule competenti e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
- Il DNA da shock termico/cellule competenti si mescola a 42 °C per 90 secondi e le piastra su piastre LB-Agar contenenti sia ampicillina (100 μg/ml) che cloramfenicolo (15 μg/ml) a 37 °C per 16-18 ore
NOTA: Il cloramfenicolo viene utilizzato per prevenire la ricombinazione tra le lunghe ripetizioni terminali.
- Il giorno successivo, coltivare cloni batterici selezionati in terreni Luria-Bertani (LB) contenenti sia ampicillina (100 μg/ml) che cloramfenicolo (15 μg/ml) a 37 °C per 16-18 ore. Estrarre il DNA utilizzando un kit Maxiprep di DNA plasmidico commerciale secondo le istruzioni del produttore.
- Sub-clonazione da vettore pENTR a Lentivettore 2K7 (Figura 1).
- Aggiungere quanto segue in una provetta da 1,5 ml e mescolare delicatamente: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotore) (60 bng)1-2,5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (con gene di interesse) (80 bng)1-2,5 μl K7 lentivettore (80 ng/μl)1 μl tampone TE, pH 82-5 μl.Totale 8 μl.
- Togliere la miscela di enzimi clonasi da -80 °C e scongelare con ghiaccio per 2 minuti. Assicurarsi che questo enzima sia un'aliquota fresca a partire da -80 °C poiché l'enzima ha un'efficienza di clonazione sostanzialmente ridotta con ripetuti cicli di congelamento-scongelamento
- Aggiungere 2 μl di enzima per reazione e mescolare bene tramite vortice e incubare la miscela di reazione della clonasi a 23-25 °C per 6-24 ore.
- Aggiungere 1 μl di soluzione di proteinasi K (fornita con il kit enzimatico) alla miscela di reazione della clonasi e incubare per 10 minuti a 37 °C.
- Trasformare la miscela di reazione della clonasi in cellule competenti e far crescere le colonie selezionate in terreni LB contenenti ampicillina (100 μg/ml) a 37 °C per 16-18 ore.
- Estrarre e purificare il DNA utilizzando un kit Miniprep di DNA plasmidico commerciale secondo le istruzioni del produttore.
- Confermare il DNA attraverso la digestione utilizzando gli enzimi di restrizione Spe I e Sac II e un tampone appropriato secondo le istruzioni del produttore per rimuovere il frammento contenente il promotore e il gene di interesse.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per verificare se il DNA subclonato ha il gene di inserimento corretto di interesse con la giusta spina dorsale vettoriale. La dimensione del vettore stesso senza il frammento inserito è di 6,7 kb. La dimensione del frammento inserito rilasciato include sia il promotore che il gene di interesse per l'inserimento. Calcolare le dimensioni previste dei frammenti dal digest per il gene specifico tramite un programma di editing della sequenza del DNA, ad esempio APE-A Plasmid Editor.
- Controllare le dimensioni sia della spina dorsale del vettore di DNA che del frammento rilasciato eseguendo un gel di agarosio all'1% in 1x tampone TAE (vedi Tabella 1) a 100 V.
- Amplificare il DNA confermato coltivando batteri in 500 ml di terreno LB contenente ampicillina (100 μg/ml) a 37 °C per 16-18 ore.
- Estrarre e purificare il DNA utilizzando un kit Maxiprep di DNA plasmidico commerciale secondo le istruzioni del produttore.
nota: Maxiprep genera in genere una quantità sufficiente di DNA necessaria per la produzione virale.
- Ripetere i passaggi 1.3.9-1.3.10 per amplificare i seguenti DNA per preparazioni lentivirali: Vettore dell'involucro (PMD2. G, 6,1 kb), vettore della confezione (pBR8,91, 12,5 kb) e un vettore lentivirale vuoto come controllo (GFP-CMV-2K7, 8,7 kb).
2. Produzione di virus 2K7
NOTA: Giorno 1:
- Il giorno della trasfezione, preparare 32 milioni di cellule T HEK293 in un pallone T175 contenente 25 ml di terreno di coltura di cellule T HEK (Human Embryonic Department) 293 (vedere Tabella 1). In alternativa, piastra 16 milioni di cellule il giorno prima della trasfezione se il tempo stringe il giorno della trasfezione.
nota: La trasfezione può avere lo stesso successo placcando le cellule il giorno della trasfezione o prima del giorno. Utilizzando una delle due alternative, il punto critico qui è assicurarsi che le cellule siano attaccate sulla superficie del piatto di coltura prima della trasfezione.
nota: Giorno 2:
- Trasfezione
- Prima della trasfezione, diluire il DNA a 1 μg/μl in tampone di acido tris-etilendiamminotetraacetico (TE) che contiene 10 mM di Tris pH 8, 1 mM di EDTA pH 8 in acqua deionizzata.
- In una provetta da 50 ml, preparare una miscela master (Tabella 2) per la trasfezione nel matraccio T175. Aggiungere il DNA al Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco preriscaldato e mescolare bene a vortice, quindi aggiungere polietilenimmina sterile (PEI) (vedere la Tabella 1 per evitare precipitazioni premature).
- Mescolare bene capovolgendo la provetta 3-4 volte e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Eseguire una modifica completa dei supporti sulle celle HEK293T. Aspirare completamente i terreni di coltura dalle cellule e nutrirli con terreni di coltura cellulare HEK293T preriscaldati (25 ml per matraccio T175).
- Aggiungere la miscela di trasfezione (miscela DNA/PEI) goccia a goccia alle cellule monostrato. Muovere delicatamente per mescolare bene e incubare le cellule trasfettate a 37 °C, 5% CO2, durante la notte.
NOTA: Giorno 3:
- Per garantire il successo della trasfezione, controllare l'espressione della proteina a fluorescenza verde (GFP) 24 ore dopo la trasfezione tramite microscopia fluorescente.
nota: Oltre il 50% delle cellule che esprimono GFP indica tipicamente una buona trasfezione.
nota: Giorno 4:
- A 48 ore dalla trasfezione, raccogliere il surnatante virale e sostituirlo con un terreno HEK293 T fresco (25 ml per matraccio T175).
- Centrifugare il surnatante virale a 1.140 x g per 10 minuti a 4 °C per eliminare i detriti cellulari dal surnatante. Trasferire il surnatante chiarificato in una provetta da 50 ml e conservarlo a 4 °C.
NOTA: Giorno 5:
- A 72 ore dalla trasfezione, raccogliere il secondo lotto di surnatante virale. Ripetere il passaggio 2.3.1 e raggruppare i surnatanti eliminati per 48 e 72 ore.
- Per concentrare il virus, centrifugare il surnatante virale a 170.000 x g per 90 minuti a 4 °C utilizzando provette per ultracentrifuga da 30 ml.
- Eliminare il surnatante e ripetere il passaggio 2.6 fino a quando tutto il surnatante eliminato è stato centrifugato, lasciando un pellet (invisibile) di virus più PEI precipitato alla base della provetta.
- Per risospendere il virus, aggiungere 500 μl di terreno SATO (vedere la Tabella 1) alle provette dell'ultracentrifuga. Agitare per 30 secondi e raschiare la base della provetta con la punta di una pipetta per allentare meccanicamente il virus. Ripeti questo passaggio 6 volte per perdere il pellet virale.
- Raggruppare il virus risospeso in provette da microcentrifuga e centrifugare molto brevemente per rimuovere il PEI insolubile. Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 μm per rimuovere le proteine.
- Aliquotare il virus in aliquote da 20 μl, 50 μl e 100 μl e conservare a -80 °C.
3. Trasduzione degli OPC
- Coltura di OPC primari in terreni SATO (piastra da 10 ml/10 cm) con fattore neurotrofico ciliare (CNTF, 10 ng/ml), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF, 10 ng/ml), neurotrofina 3 (NT3, 1 ng/ml) e forskolina (4,2 μg/ml) a 37 °C, 8% CO2 per 24 ore dopo la dissezione.
- Aspirare completamente il terreno di coltura OPC e alimentare le cellule con terreni SATO appena fatti (10 ml) con fattori di crescita (vedere sopra al punto 3.1).
- Aggiungere il virus agli OPC alla concentrazione ottimale, coltivare gli OPC per altre 48 ore.
4. Semina OPC per co-colture mielinizzanti (Figura 2)
- Per rimuovere gli OPC dalla superficie, sciacquare prima le piastre OPC con 8 ml di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) due volte, quindi incubare le cellule con 5 ml di tripsina-EDTA calda allo 0,05% diluita 1:10 con EBSS a 37 °C per 2 minuti.
- Neutralizzare la tripsina con il 30% di FBS in EBSS (5 ml) e rimuovere le cellule dalla piastra mediante pipettaggio. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 180 x g per 15 minuti a RT.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno SATO preriscaldato, seguito dalla conta cellulare.
- Prima della semina OPC, aspirare completamente il terreno dalla piastra di coltura DRG. Seminare delicatamente 200.000 OPC goccia a goccia sui neuroni DRG come descritto in precedenza.
nota: Il volume totale di semina dell'OPC deve essere inferiore a 200 μl per vetrino coprioggetti da 22 mm.
- Lasciare depositare le cellule senza spostare la piastra per 10 minuti nella cappa di coltura tissutale, quindi rabboccare delicatamente con 1 ml di terreno SATO preriscaldato per pozzetto.
- Riplaccare le OPC sorelle rimanenti con terreni SATO con fattori di crescita (vedere il passaggio 6.1). Usa queste OPC sorelle per verificare l'espressione della proteina di interesse.
- Dopo 24 ore, sostituire il terreno SATO con il terreno di co-coltura (2 ml/pozzetto) contenente terreno SATO (nessun fattore) e neurobasale (v/v) con l'1% di B2Mantenere le co-colture per 14 giorni con cambio del terreno ogni 2-3 giorni.
- Valutare le co-colture per l'espressione della proteina mielinica mediante analisi western blot e visualizzare la formazione di segmenti assonali mielinizzati mediante doppia immunocolorazione con anticorpi contro i marcatori della proteina di base della mielina e i marcatori neuronali.
