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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Ordinamento Manuale di Neuroni di Topo Marcati Fluorescentemente
- Tirare i microcapillari di vetro (vedere la tabella dei materiali) fino a un diametro di uscita di 10–15 μm utilizzando un estrattore capillare con le seguenti impostazioni: calore: 508, trazione: vuoto, vel: vuoto, tempo: vuoto.
- Collegare un tubo flessibile in silicone da 120-150 cm (diametro interno ~0,8 mm) a un filtro per siringa a membrana in polivinilidendifluoruro (PVDF) da 0,2 μm e a una valvola a due vie utilizzando connettori per tubi adatti.
- Preparare 500 ml di liquido cerebrospinale artificiale refrigerato (4 °C) (ACSF, Tabella 1) e ossigenare facendo gorgogliare ossigeno bilanciato al 5% di anidride carbonica attraverso una pietra porosa per 15 minuti o fino a quando la soluzione non si chiarisce completamente.
- Preparare 100 ml di ACSF con un cocktail di bloccanti dell'attività in un becher da 150 ml (Tabella 1).
- Preparare 100 mL di ACSF con 1 mg/mL di proteasi Streptococcus frazione IV in un becher da 150 mL (Tabella 1).
- Preparare 100 ml di ACSF con una soluzione di siero fetale bovino (FBS) all'1% in un becher da 150 ml e ossigenare con ossigeno bilanciato al 5% di anidride carbonica attraverso una pietra porosa.
- Seziona il cervello da un topo soppresso aprendo il cranio con una piccola forbice ed estraendo il cervello fresco usando una pinza fine senza danneggiare la corteccia><.
nota: I topi di qualsiasi ceppo, età e sesso possono essere utilizzati a piacere. Non congelare il cervello o eseguire la selezione manuale su topi iniettati con virus o altri agenti pericolosi/infettivi.
- Mantenere il cervello in ACSF raffreddato e ossigenato, lasciando una pietra porosa attaccata al 5% di anidride carbonica di ossigeno durante l'intera durata del sezionamento.
- Posizionare il cervello sul mandrino del vibratomo e tagliare le sezioni coronali o sagittali a uno spessore di 300 μm. Raccogli tutte le sezioni necessarie per ottenere un minimo di ~10-50 celle etichettate fino a diverse centinaia di celle. Mettere le fette su un portafette in rete di cotone, posto all'interno di un becher in modo che siano immerse in ACSF ossigenato.
- Spostare le fette fresche in un bicchiere contenente ACSF con bloccanti dell'attività e bloccare per 15-20 minuti a temperatura ambiente. Continua a far gorgogliare l'ossigeno usando la pietra porosa.
- Spostare le fette in un becher contenente ACSF con la soluzione di proteasi per eseguire una digestione delicata a temperatura ambiente: 20-30 minuti per gli animali P4-14 o fino a 45-60 minuti per gli animali P28-56. Continua a far gorgogliare ossigeno.
- Lavare l'ACSF con proteasi spostando le fette nel becher contenente ACSF con soluzione bloccante dell'attività per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Continua a far gorgogliare ossigeno.
- Spostare le singole sezioni in una piastra di Petri da 100 mm contenente ACSF con l'1% di FBS a temperatura ambiente. In un endoscopio di dissezione fluorescente, microdissezionare aree e strati di interesse con un minimo di 10-50 cellule (fino a poche centinaia). Eseguire la microdissezione con un paio di pinze sottili o attaccando aghi per iniezione da 22-28 G su supporti di legno (spiedini).
- Utilizzando una pipetta Pasteur, spostare i pezzi microdissezionati in una provetta per microfuge da 2 mL contenente ~0,8 mL di FBS all'1% in soluzione ACSF.
- Triturare il tessuto sezionato nella provetta per microfugo a temperatura ambiente. Prepara tre pipette Pasteur a gambo lungo con diametri di uscita decrescenti facendole rotolare su una fiamma viva. Eseguire ~10 colpi con ogni pipetta, iniziando dalla più grande e finendo con la più piccola.
- Erogare le cellule dissociate in una piastra di Petri da 100 mm contenente ACSF ossigenato (la piastra di Petri può essere rivestita sottilmente con 5 mm di agar all'1% o composto siliconico trasparente in rapporto 1:10, se lo si desidera). Conservare a temperatura ambiente.
- Attendere ~5-7 minuti affinché le cellule si stabilizzino gradualmente, quindi osservare il segnale GFP/RFP al microscopio da dissezione.
nota: Singole cellule, detriti e piccoli grumi saranno visibili in campo chiaro (BF).
- Prelevare 10-15 cellule GFP/RFP alla volta utilizzando una pipetta capillare (dal passaggio 1.1) collegata a un tubo flessibile in silicone (diametro interno 0,4-0,8 mm) ed erogare le cellule in una piastra di Petri da 100 mm contenente ACSF ossigenato fresco.
- Bloccando l'estremità della valvola del tubo con la linguetta, posizionare il capillare vicino alla cella di interesse. Catturare le cellule utilizzando l'azione capillare dopo aver scaricato il blocco e bloccare nuovamente rapidamente per evitare che il liquido in eccesso entri nella pipetta. Erogare le cellule su una piastra di Petri da 100 mm con ACSF ossigenato fresco soffiando delicatamente, osservando la punta capillare sotto l'ottica a fluorescenza del microscopio di dissezione. Cerca di raccogliere ~100-150 celle in totale.
- Ripetere il passaggio 1.19 una o due volte (a seconda dei detriti) e trasferire un totale di ~50-75 celle in una nuova piastra di Petri da 100 mm, assicurandosi che i contaminanti come i detriti siano minimi nelle ottiche DIC (Differential Interference Contrast) in campo chiaro.
Tabella 1: Elenco di soluzioni e buffer.
| buffer | articolo | concentrazione | Quantità (μL) |
| Buffer di raccolta dei campioni | Inibitore della ribonucleasi ricombinante | | 55 |
| Rcc | 1:50K diluito | 110 |
| Acqua priva di nucleasi | | 605 |
| Aliquot 43.75 μL di quanto sopra in 16 provette (2 strisce da 8; 200 μL di provette PCR); aggiungere quanto segue per provetta |
| Inneschi UMI (ad es. N10B1-N10B16) | 1 ng/μl | 6,25 μl/provetta |
| Volume finale in ogni provetta 50 μL (ogni provetta può essere divisa in aliquote da 25 μL e congelata a -80 °C) |
| soluzioni: | articolo | concentrazione | importo |
| CSF: per sciogliere 5 L | NaCl | 126 mM | 36,8 g |
| Kcl | 3 mM | 1,15 g |
| NaH2PO4 | 1,25 mM | 0,75 g |
| NaHCO3 | 20 mM | 8,4 g |
| A 500 ml di ACSF, bollire l'ossigeno per 10-15 minuti, quindi aggiungere ogni volta il seguente fresco: |
| D-glucosio | 20 mM | 1,8 g |
| MgSO4 | 2 mM | 0,5 mL da 4 M stock |
| CaCl2 | 2 mM | 0,5 mL da 4 M stock |
| Mantieni ACSF ossigenato per tutto il tempo |
| soluzioni: | articolo | Concentrazione |
| Cocktail bloccante l'attività: fai una scorta 100x |
| A 100 ml di ACSF aggiungere | | |
| APV | 0,05 mM | |
| CNQX | 0,02 mM | |
| TTX | 0.0001 mM (0.1 μM) |
| soluzioni: | articolo | importo | |
| Solzione proteasi (100 mL) | Proteasi da Streptomyces griseus | 100 mg | |
| Siero fetale bovino: fonte commerciale, aliquota in 500 μL per ogni utilizzo. |