1. Raccolta e coltura di cellule del lignaggio OL (OL)
NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Il giorno dopo l'agitazione, preparare il terreno Bottenstein-Sato (BS) secondo la Tabella 1.
- Sciacquare le piastre di Petri rivestite 3 volte con acqua distillata sterile.
- Raccogliere il surnatante dei flaconi contenenti principalmente cellule del lignaggio OL, ma anche alcune cellule microgliali e impiattarlo su piastre di Petri da 100 mm non rivestite.
nota: Questo passaggio consente la rimozione delle cellule microgliali attraverso l'adesione rapida differenziale sulla superficie della piastra.
- Incubare le piastre di Petri per 15 minuti in un'incubatrice umidificata a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Riempire ogni matraccio T150 con 25 mL di terreno di coltura caldo appena preparato e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO2 fino al secondo scuotimento.
- Trasferire il surnatante dalle piastre di Petri in nuove piastre di Petri da 100 mm non rivestite per consentire l'adesione delle cellule microgliali residue.
- Incubare le piastre di Petri per 15 minuti in un'incubatrice umidificata a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Rimuovere il surnatante, che contiene cellule del lignaggio OL non aderenti, e trasferirlo in provette da 50 mL (surnatante da 2 piastre di Petri per una provetta da 50 mL). Scartare le piastre di Petri impiattate con microglia.
- Centrifugare il surnatante per 5 minuti a 423 x g. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di terreno BS. Raccogliere tutti i pellet in una comune provetta da 50 ml e regolare il volume a 10 ml con il terreno BS.
- Determinare la densità cellulare contando le cellule al microscopio.
nota: Si deve ottenere una densità cellulare compresa tra 3 x 105 cellule/mL e 5 x 105 cellule/mL.
- Aggiungere 20 mL di BS se la densità cellulare è superiore o uguale a 4 x 105 cellule/mL per ottenere un volume finale di 30 mL, oppure aggiungere solo 10 mL di BS se la densità cellulare è inferiore a 4 x 105 cellule/mL per ottenere un volume finale di 20 mL.
- Piastra con due o tre piastre di Petri pre-rivestite da 100 mm con 10 mL di sospensione cellulare. Incubare in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Eliminare i detriti dalle piastre di Petri rinfrescando tutto il mezzo BS 2 ore dopo.
nota: Esaminare la coltura al microscopio prima e dopo la rimozione per verificare la densità cellulare e l'efficienza della rimozione dei detriti.
- Incubare per 2 giorni in terreno BS in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO2.
nota: Esamina la coltura al microscopio. La confluenza dovrebbe essere compresa tra il 70% e l'80%.
2. Produzione OCM
NOTA: Esegui questi passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Preparare NB-B27low medium secondo la Tabella 2.
- Rinnovare il terreno di coltura con 10 mL di terreno caldo NB-B27low. Incubare per 2 giorni in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Raccogli l'OCM, cioè il surnatante contenente fattori secreti da OL. Sterilizzare con filtro OCM utilizzando un filtro da 0,22 μm.
nota: Conservare OCM a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
Tabella 1: Preparazione dei terreni Bottenstein-Sato (BS).
| Bottenstein-Sato (BS) media | Concentrazione finale |
| Aquila di Dulbecco modificata media | |
| Penicillina-Streptomicina | 100 UI/mL |
| apo-transferrina umana | 100 μg/mL |
| BSA (albumina sierica bovina) | 100 μg/mL |
| insulina | 5 μg/mL |
| PDGF | 10 ng/mL |
| progesterone | 62 ng/mL |
| Putrescina dicloridrato | 16 μg/mL |
| Selenito di sodio | 40 ng/mL |
| T3 (sale sodico di 3,3',5-Triiodo-L-tirolina) | 30 ng/mL |
| T4 (L-tiroxina) | 40 ng/mL |
Tabella 2: Preparazione dei terreni NB-B27low e NB-B27.
| NB-B27 a basso contenuto di media | Concentrazione finale |
| Neurobasale | |
| Supplemento B27 | 0,5 volte |
| L-glutammina | 0,5 mM |
| Penicillina-Streptomicina | 100 UI/mL |
| Supporti NB-B27 | Concentrazione finale |
| Neurobasale | |
| Supplemento B27 | 1x |
| L-glutammina | 0,5 mM |
| Penicillina-Streptomicina | 100 UI/mL |
