- Coltura compartimentata di gangli della radice dorsale di ratto (DRG), oligodendrociti (OPC) e hGC (cellule di glioma umano)
1. Preparazione di piatti di coltura a compartimenti stagni
NOTA: Esegui i seguenti passaggi nei giorni precedenti la raccolta pianificata dei DRG.
- Assemblare i piatti di coltura a compartimenti.
- Diluire la soluzione madre di collagene a 500 μg/mL in H2O distillato sterile; mescolare accuratamente.
- Con una pipetta di trasferimento sterile, riempire una piastra di coltura da 35 mm con 2 mL di soluzione di collagene; rimuovere la soluzione, lasciando dietro di sé una sottile pellicola di collagene, e posizionarla nella successiva piastra da 35 mm. Ripeti questo processo, aggiungendo altra soluzione di collagene se necessario, fino a quando tutti i piatti non sono stati ricoperti.
- Una volta rivestite tutte le piastre, posizionarle in un vassoio di coltura da 245 mm x 245 mm e adagiare tre garze da 1 mm x 1 mm al centro del vassoio.
- Per polimerizzare il collagene, bagnare le garze con 1 mL di idrossido di ammonio concentrato e coprire le vaschette per 15 minuti.
- Rimuovere le garze e lasciare asciugare le piastre da 35 mm nella cappa a flusso laminare.
- Mentre le stoviglie si asciugano, caricare il cilindro dell'applicatore di grasso per siringa con grasso ad alto vuoto. Collocare le camere a compartimenti in una bottiglia per terreni a bocca larga riempita con acqua distillata. Sterilizzare entrambi in autoclave e lasciare raffreddare.
- Lima la punta di un ago da 18 g per ottenere una punta smussata. Sterilizzare in etanolo al 70%. Collegare l'ago alla siringa del grasso.
- Sterilizzare il rastrello immergendolo in etanolo al 70%; lasciarlo asciugare all'aria nella cappa a flusso laminare.
- Togliete il coperchio da una pirofila asciutta da 35 mm rivestita di collagene. Tenere il piatto tra il pollice e l'indice. Tenere il rastrello con l'altra mano. Applicare una pressione decisa per creare graffi larghi anche 200 μM al centro del piatto.
- Usando una pipetta da pascolo, posizionare due gocce di Supplemented Neuronal Basal Medium al centro dei graffi.
- Ripetere i passaggi 1.1.10-1.1.11 fino a quando tutte le stoviglie non sono state graffiate.
- Asciugare le camere a compartimenti in una cappa a flusso laminare.
- Con una pinza emostatica sterile, afferrare una camera a scomparti dal divisore centrale. Capovolgere la pinza emostatica in modo che il fondo della camera sia rivolto verso l'alto.
- Applicare grasso siliconico sulla camera a scomparti, iniziando dall'alto. Assicurarsi che il grasso sia posizionato in modo ordinato e si sovrapponga a tutti gli angoli.
- Togliete il coperchio da una pirofila da 35 mm. Capovolgere il piatto e posizionare i graffi sulla camera. Picchiettare delicatamente sul fondo della piastra con un paio di pinze.
- Capovolgere delicatamente la piastra utilizzando la pinza emostatica. Rilascia la pinza.
- Metti un mucchio di grasso alla base dello scomparto centrale. Riempire ogni camera con il terreno basale neuronale (NB) integrato e verificare la presenza di perdite. Sigillare le perdite con grasso siliconico secondo necessità.
- Continuare ad assemblare tutti i piatti di coltura e conservare per una notte a 37°C, 5% CO2.
