Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di soluzioni e materiali
- Preparare la soluzione di Ringer miscelando 123,3 mM di NaCl, 1,53 mM di CaCl2, 4,96 mM di KCl, 0,809 mM di Na2HPO4 e 0,147 mM di KH2PO4 (vedere la Tabella dei materiali). Regolare il pH a 7,4 e filtrare sterilizzare in flaconi da 100 ml. Conservare in un luogo pulito e asciutto. Non lavare le bottiglie con sapone (trattare come vetreria per colture di tessuti).
- Preparare 1 mg/mL di soluzione madre di fibronectina (FN) (vedere la Tabella dei Materiali) sciogliendo FN in una soluzione sterile di Ringer e conservare in aliquote da 100 μL a -80 °C (stabile per almeno 4 anni).
- Preparare terreni di coltura completi integrando i terreni L15 con 0,8% di L-glutammina, 0,08% di penicillina/streptomicina, 10% di FBS ed estratto di embrioni di pollo al 10%. Creare aliquote da 3 mL e conservarle a -20 °C o -80 °C.
nota: Se le colture vengono incubate in un incubatore di CO2, il Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12) di Dulbecco deve essere sostituito con L15, che viene tamponato per l'aria.
- Preparare i telai di supporto della carta da filtro (rettangoli di carta di circa 1 cm x 1,5 cm con due o tre fori che si sovrappongono sull'asse lungo).
- Praticare dei fori lungo il bordo di un grande pezzo di carta da filtro utilizzando un punzone standard a tre fori, tagliare/rifilare il bordo perforato in una striscia, quindi tagliare la striscia tra i fori in rettangoli di ~ 1,5 cm di lunghezza. Carte da filtro in autoclave prima dell'uso (opzionale).
- Raccogli gli strumenti di dissezione, tra cui pinze fini (#5), pinze smussate, forbici da dissezione, forbici a molla e aghi di tungsteno affilati.
2. Preparazione di piatti di cultura
- Selezionare i piatti di coltura di piegatura neurale (vedere la Tabella dei materiali) appropriati per l'applicazione a valle.
- Per le colture che verranno fissate e colorate, utilizzare vetrini coprioggetti inseriti in piastre di coltura tissutale a più pozzetti.
nota: I vetrini coprioggetti che corrispondono alle dimensioni del pozzetto si muoveranno meno con la miscelazione del fluido, rendendo meno probabile che gli espianti si spostino e che aderiscano al vetrino coprioggetti piuttosto che al fondo del piatto.
- Selezionare le piastre a camera singola o a camera divisa con fondo in vetro (vedere la Tabella dei materiali) per l'imaging dal vivo con un microscopio invertito.
- Per l'imaging dal vivo su un microscopio verticale o stereomicroscopio, utilizzare piastre per coltura tissutale otticamente appropriate a 6, 12 o 24 pozzetti.
- Selezionate piastre di coltura di tessuti plastici per la raccolta di massa di cellule della cresta neurale migratoria per analisi ad alto rendimento.
- Aggiungere 10 U/mL di penicillina e 10 μg/mL di streptomicina a un flacone da 100 mL di soluzione sterile di Ringer (ad esempio, 100 μL di penicillina da 10.000 U/mL e 10.000 μg/mL di streptomicina, per ottenere il P/S di Ringer). Usa il P/S di Ringer entro 1 settimana.
- Scongelare un'aliquota di 1 mg/mL di FN con ghiaccio. Diluire con P/S di Ringer a una concentrazione di 10-100 μg/mL di FN.
- Pipetta una soluzione FN sufficiente a coprire il fondo del pozzetto o del piatto. Ad esempio, 100 μl per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti, 500 μl per una piastra da 35 mm.
- Riposizionare il coperchio e incubare le piastre o le piastre con la soluzione FN in un'incubatrice umidificata (o in un vassoio coperto con tovaglioli di carta imbevuti di acqua distillata) a 38 °C (100 °F) per almeno 1 ora durante la dissezione delle pieghe neurali.
3. Sezionare le pieghe neurali
- Trasferisci un embrione in un piatto pulito contenente la soluzione P/S di Ringer e risciacqua l'embrione tenendo il telaio di carta da filtro con una pinza e agitando delicatamente avanti e indietro per eliminare il tuorlo che oscura la vista dell'embrione. Scambia il P/S della suoneria o trasferiscilo in un piatto fresco se diventa torbido.
- Posizionare l'embrione con il lato dorsale/montatura rivolto verso l'alto sotto un microscopio da dissezione. Lasciando l'embrione sul telaio di carta per tenerlo teso e tenuto in posizione, rimuovere la membrana vitellina usando una pinza per esporre le pieghe neurali><.
nota: Se l'embrione cade dal telaio di carta, può essere steso in piano nel piatto o appuntato su un piatto rivestito di sylgard per la dissezione.
- Usando le forbici a molla o un ago di tungsteno affilato, asporta con cura le pieghe neurali del mesencefalo. Includi il tessuto caudale alle vescicole ottiche in espansione e rostrale al romboencefalo, dove le costrizioni dei rombomeri stanno appena iniziando a comparire (anche la mezzaluna cardiaca è un utile indicatore, Figura 1B, C). Fare attenzione a asportare l'aspetto più dorsale della piega neurale con un tubo neurale contaminante minimo e un ectoderma non neurale (Figura 1C).
- Trasferisci le pieghe neurali in un piatto pulito contenente il P/S di Ringer usando un pipettatore P20 o una pipetta Pasteur sterile in vetro risciacquata con il P/S di Ringer tuorlo (questo blocca la plastica o il vetro per evitare che il tessuto si attacchi). Conservare le pieghe raccolte sul ghiaccio mentre si sezionano le pieghe aggiuntive.
4. Placcatura delle pieghe neurali
- Scongelare un'aliquota di terreno di coltura completo (sezione 1, fase 3). Aggiungere 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina e sterilizzare con filtro. Mantenere il terreno preparato a 37-38 °C mentre si eseguono altri passaggi.
- Rimuovere le piastre di coltura dall'incubatrice (sezione 2, passaggio 5). Utilizzando un pipettatore o una pipetta Pasteur, rimuovere la soluzione FN da vetrini, piatti o pozzetti. Dopo aver risciacquato il substrato rivestito di FN con Ringer's P/S, aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura completo alle piastre o ai pozzetti (500 μl per i pozzetti in una piastra a 24 pozzetti, 2 mL per una piastra da 35 mm o una piastra a sei pozzetti).
nota: Volumi più piccoli possono conservare reagenti costosi (ad esempio, fino a 200 μl per una piastra a 24 pozzetti), ma assicurano che la piastra sia sufficientemente umidificata per evitare l'evaporazione.
- Utilizzando un pipettatore p20 o p200, per prima cosa, sciacquare il puntale della pipetta con il tuorlo Ringer's P/S per bloccare la plastica ed evitare che il fazzoletto si attacchi. Quindi, trasferire le pieghe neurali isolate sui vetrini coprioggetti rivestiti di FN, avendo cura di trasferire il minor P/S possibile di Ringer. Posizionare le pieghe verso il centro del vetrino coprioggetti rivestito con FN.
nota: Una o più pieghe neurali possono essere placcate su un vetrino coprioggetti da 12 mm in un pozzetto da 19 mm, fino a 50 su una piastra da 35 mm.
- Dopo aver lasciato riposare gli espianti per 10-15 minuti, posizionarli in una camera umidificata a 38 °C (100 °F) trasportando lentamente e con attenzione le piastre di coltura con pieghe neurali placcate. Ciò ridurrà al minimo lo spostamento delle pieghe neurali nei pozzetti, assicurando che rimangano disperse e aderiscano a eventuali vetrini><.
nota: Quando si utilizza L15 (non DMEM), le piastre di coltura per espianti possono anche essere incubate in un'incubatrice per uova utilizzando un vassoio coperto con carta assorbente inumidita.
- Incubare le colture di pieghe neurali nell'incubatrice umidificata per la durata della migrazione attiva (circa 16-20 ore in totale, Figura 2).
