Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparativi
NOTA: Le soluzioni e gli strumenti descritti in questa sezione possono essere realizzati con largo anticipo e utilizzati il giorno della dissezione e della registrazione.
- Preparare i terreni Liebovitz integrati con 10 mM di HEPES (soluzione di L-15). I passaggi seguenti descrivono la preparazione di 1 L di soluzione di L-15.
- Versare 990 mL di H2O deionizzato in un becher. Misurare e aggiungere 2,386 g (10 mM) di HEPES. Aggiungere un flacone da 1 L di soluzione di L-15 in polvere.
NOTA: L-15 in polvere ha una durata di conservazione più lunga e occupa meno spazio di stoccaggio. In alternativa, acquistare la soluzione di L-15 e integrarla con HEPES. Quest'ultima opzione ha anche la possibilità di utilizzare una soluzione priva di fenolo, utile per l'imaging a fluorescenza.
- Mescolare la soluzione su una piastra di agitazione. Utilizzando un pHmetro, aggiungere lentamente 1 N di idrossido di sodio (NaOH) per ottenere un pH compreso tra 7,34 e 7,36.
- Aggiungere H2O deionizzato fino a quando la soluzione raggiunge un volume di 1.000 mL. Filtrare la soluzione utilizzando una membrana con pori di 0,22 μm.
nota: La soluzione di L-15 può essere conservata a 4 °C per 1-2 settimane. Se si utilizza L-15 a base di rosso fenolo, la soluzione diventerà rosa se troppo basica (pH > 7,4) o arancione se troppo acida (pH < 7,34).
- Preparare il terreno di coltura per i neuroni gangliari vestibolari (VGN). Seguire i passaggi seguenti per preparare 50 ml di terreno di coltura:
- Aggiungere 47,5 mL di terreno minimo essenziale GluMAX-I a un becher di vetro pulito.
- Misurare e aggiungere 0,1194 g (10 mM) di HEPES. Questo tampone aggiuntivo resiste alle variazioni di pH mentre le cellule si depositano prima di essere spostate nell'incubatore.
- Aggiungere 2,5 ml di siero fetale bovino (FBS). Ciò rende il 5% in volume di FBS in un volume totale di 50 mL di terreno.
- Mescolare la soluzione su una piastra di agitazione. Utilizzando un pHmetro, aggiungere lentamente 1 N di NaOH per ottenere un pH compreso tra 7,38 e 7,4.
- Aggiungere 0,5 ml di penicillina-streptomicina. Filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,22 μm. Conservare la soluzione a 4 °C.
- Almeno 30 minuti prima dell'uso, trasferire il terreno di coltura in un pallone di coltura tissutale con tappo ventilato. Porre il matraccio con il terreno di coltura in un incubatore con una concentrazione di CO2 del 5% a 37 °C.
2. Fabbricazione di pipette di triturazione
NOTA: Le pipette di triturazione possono essere riutilizzate per più esperimenti. Sciacquare le pipette con etanolo, acqua e soluzione di L-15 prima di ogni utilizzo e pulirle con acqua ed etanolo dopo ogni utilizzo. Conservare con cura tra un utilizzo e l'altro.
- Per preparare le pipette di triturazione per la dissociazione cellulare, tenere una pipetta di vetro Pasteur alla fiamma di un bruciatore Bunsen. Una volta che la punta del bicchiere inizia a sciogliersi, allungare il bicchiere fino al diametro della punta desiderato. Tirare un'estremità della pipetta lontano dalla fiamma per creare una piccola curvatura.
- Avvicinare la pipetta piegata a un microscopio. Usando una tessera segnapunti, incidi e rompi il bicchiere al diametro desiderato.
- Passare la punta della pipetta sopra la fiamma del bruciatore Bunsen. Questo luciderà rapidamente i bordi ruvidi vicino alla punta. Verificare che la punta non sia sigillata dalla fiamma.
- Ripetere il processo fino a quando non sono state preparate quattro o cinque pipette di dimensioni variabili.
3. Estrazione del ganglio vestibolare e placcatura dei neuroni vestibolari
- Preparazione per la dissezione
- Preparare una miscela enzimatica di soluzione di L-15 con lo 0,05% di collagenasi e lo 0,25% di tripsina. Ad esempio, aggiungere 0,001 g di collagenasi e 0,005 g di tripsina a 2 ml di soluzione di L-15 in un becher, aggiungere un piccolo agitatore magnetico e mescolare fino a quando non sarà completamente miscelato. Mettere da parte a temperatura ambiente.
- Preparare una ghigliottina ottenuta in commercio posizionando tovaglioli di carta ai lati e sotto la ghigliottina per ridurre al minimo l'esposizione del piano di lavoro e di altre superfici al sangue e ad altri materiali biologici.
- Disponi grandi forbici in acciaio inossidabile, grandi pinze e grandi forbici a molla. Tieni a portata di mano un grande flacone spray con etanolo al 70% per la pulizia della testa.
- Riempire un becher da 100 ml con una soluzione di L-15 e metterlo sul ghiaccio. Ossigenare la soluzione di L-15.
- Disporre le forbici a molla, le forbici chirurgiche, le pinze, il bisturi e la pipetta di trasferimento (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare una piastra di Petri da 60 mm (per la dissezione grossolana) e due piastre di Petri da 35 mm (per la pulizia/dissezione fine dei gangli). Riempire la piastra da 60 mm con una soluzione ossigenata di L-15 utilizzando una siringa da 30 ml con puntale filtrante da 0,22 μm.
- Eutanasia, pulizia della testa e emisezione
- Pesare i cuccioli per calcolare il dosaggio appropriato di diluizione fatal-plus da somministrare per via intraperitoneale (~0,01 ml per 10 g).
- Una volta raggiunto un piano profondo di anestesia, come valutato dalla mancanza di risposta al pizzicamento del dito del piede, decapitare usando la ghigliottina.
- Sciacquare accuratamente la testina con etanolo al 70% e poi accuratamente con una soluzione di L-15.
- Rimuovere completamente la pelle dal cranio. Taglia in due la testa usando grandi forbici a molla iniziando dal punto di ingresso del midollo spinale al cervello e facendo due tagli, il primo attraverso la parte superiore del cranio e il secondo attraverso la parte inferiore della mascella. Termina di dividere in due la testa usando le forbici chirurgiche.
- Posizionare entrambe le metà della testa con il cervello rivolto verso il basso in una capsula di Petri da 60 mm riempita con soluzione di L-15. Posizionare il fazzoletto fresco non attualmente sezionato sul ghiaccio.
- Estrazione del ganglio vestibolare superiore
- Estrarre il cervello usando le forbici chirurgiche chiuse. Recidere e rimuovere il nervo cranico per staccare completamente il cervello dal cranio.
nota: A questo punto, la capsula otica (a forma di numero 8) dovrebbe essere visibile nella parte posteriore della testa.
- Usando una pinza e iniziando dalla parte posteriore della testa, estrarre il materiale membranoso trasparente.
- Taglia la parte superiore del cranio usando le forbici chirurgiche. Rimuovere il tessuto in eccesso dalla parte posteriore della testa e del collo per rendere l'area di dissezione e la capsula otica più pulite e di più facile accesso.
nota: Evita di rendere il piatto troppo torbido scartando il tessuto in eccesso durante la procedura.
- Trasferire il fazzoletto in una seconda piastra di Petri con una soluzione fresca di L-15. Localizzare la capsula otica e i nervi uditivi, vestibolari superiori e vestibolari inferiori. Tagliare il nervo uditivo e separare i gangli superiori e inferiori usando piccole forbici a molla.
nota: Sebbene i somata del nervo vestibolare si trovino sia nei gangli inferiori (più sottili) che in quelli superiori (più spessi), le cellule estratte dal ganglio superiore hanno una sopravvivenza migliore.
- Usando un bisturi, radere delicatamente la cresta ossea per indebolire l'area ossea sotto la quale il nervo si tuffa nella capsula ossea. Rimuovere con cura i detriti con una pinza fine, esponendo l'intera parte gonfia del ganglio.
- Usa le forbici a molla fine per tagliare e separare il ganglio dal ramo nervoso periferico che si sta tuffando verso l'utricolo.
- Rimuovere il ganglio superiore usando una pinza fine, facendo attenzione a non pizzicare troppo vicino al tessuto gangliare. Trasferire in una capsula di Petri da 35 mm con soluzione fresca di L-15.
- Prima di procedere, preriscaldare la soluzione enzimatica: versare la miscela enzimatica in una piastra Petri da 35 mm e porre in un'incubatrice a 37 °C per 10-15 min.
- Pulisci il ganglio usando una pinza fine e piccole forbici a molla rimuovendo l'osso (che appare bianco e cristallizzato nella struttura), il tessuto in eccesso, le fibre nervose e qualsiasi altra struttura superflua. Fare attenzione a ridurre al minimo la rimozione di qualsiasi tessuto gangliare.
- Dissociazione e placcatura tissutale
- Trasferire i gangli puliti nella soluzione enzimatica preriscaldata e rimetterla nell'incubatore per 10-40 minuti. Il trattamento enzimatico è completo quando il tessuto inizia a rompersi, ma rimane in un unico pezzo. Il trattamento eccessivo del tessuto con enzimi comporterà la completa dissoluzione dei gangli prima della triturazione.
NOTA: La quantità di tempo in cui il tessuto viene sottoposto al trattamento enzimatico dipende dall'età dell'animale. Ad esempio, i gangli dei ratti P9 vengono trattati con enzimi per 25 minuti e i gangli dei ratti P15 vengono trattati con enzimi per 35 minuti.
- Trasferire i gangli nella capsula di Petri da 35 mm con una soluzione fresca di L-15 e incubare per 2-3 minuti.
- Trasferire i gangli in un'altra piastra di Petri da 35 mm riempita con terreno di coltura filtrato.
- Utilizzando una micropipetta da 200 μl, pipettare una goccia da ~150 μl di terreno di coltura filtrato su un piatto con fondo di vetro rivestito. Non aggiungere troppa soluzione, poiché è importante mantenere la tensione superficiale per formare una bolla di soluzione che rimane sopra il vetrino coprioggetti.
- Trasferire il numero desiderato di gangli (da uno a quattro) sul vetrino coprioggetti.
- Prelevare una piccola quantità di terreno di coltura dalla piastra di coltura per sciacquare la pipetta di triturazione con il terreno per evitare che il tessuto si attacchi ai lati della pipetta di vetro. Triturare facendo passare delicatamente e ripetutamente il tessuto attraverso la pipetta fino a quando i gangli non sono sufficientemente dissociati.
nota: Non sovraccaricare il tessuto per tentare sospensioni di singole cellule o lasciare che le cellule si schiantino sul fondo del piatto usando una pressione positiva eccessiva. Inoltre, evita di formare bolle d'aria, poiché ciò ridurrà la sopravvivenza cellulare. Una triturazione delicata è la chiave per ottenere una sopravvivenza cellulare di successo.
- Lasciare riposare le cellule per 5 minuti. Controllare al microscopio ottico se le cellule si sono depositate sul vetrino.
- Posizionare con cura un piatto di coltura in un'incubatrice a 37 °C per 12-24 ore. Ancora una volta, assicurati di mantenere intatta la bolla di soluzione.
nota: Durante la coltura per più di 24 ore, aggiornare quotidianamente il terreno di coltura. Questo può essere un possibile punto di pausa.
