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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Dissociazione tissutale
NOTA: Tutte le seguenti procedure vengono eseguite in una cappa di biosicurezza designata per colture tissutali sterili utilizzando tecnica asettica e materiali sterili.
- Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% contenente 0,53 mM EDTA a ciascuna provetta conica da 15 mL di DMEM da 9 mL e tessuto per iniziare la lisi tissutale.
nota: Il DMEM contiene un'elevata quantità di cloruro di calcio, che può agire come inibitore della tripsina. Se la dissociazione non è completa seguendo i passaggi descritti, è possibile utilizzare la soluzione salina bilanciata di Hanks senza calcio o magnesio. Dopo la tripsinizzazione, l'enzima può essere neutralizzato aggiungendo un inibitore della tripsina, anche se il calcio dovrebbe essere aggiunto nuovamente alla soluzione in quanto è un cofattore per la DNasi I, che viene utilizzata nelle fasi successive.
- Triturare con una pipetta da 10 mL circa 20x.
- Trasferire le sospensioni cellulari in provette coniche vuote da 50 mL.
- Incubare la soluzione a 37 °C, 5% CO2 per 15 min, agitando delicatamente i lisati dopo 8 min.
- Aggiungere 5 mL di MGM e 200 μL (5 mg/mL) di DNasi I a ciascuna provetta per una concentrazione finale di 50 μg/mL.
- Triturare ogni lisato con una pipetta da 10 mL 10x.
- Lasciare riposare le sospensioni cellulari per 3 minuti a temperatura ambiente per consentire al tessuto non dissociato di depositarsi sul fondo delle provette.
- Trasferire le sospensioni cellulari in nuove provette coniche da 50 mL, lasciando dietro di sé il tessuto non dissociato.
nota: Le fasi di lisi e triturazione sopra descritte limitano significativamente la quantità di tessuto non dissociato.
- Centrifugare le provette a 300 x g per 3 minuti a 4 °C senza freni.
- Aspirare il surnatante e risospendere i pellet cellulari rimanenti in 5 mL di MGM.
- Triturare il pellet con una pipetta da 5 mL 20x.
- Piastra le sospensioni cellulari da 5 mL su matracci T25 rivestiti.
- Incubare le cellule a 37 °C, 5% di CO2 e cambiare il terreno inizialmente dopo 24 ore per rimuovere i detriti cellulari.
nota: Alcuni protocolli consigliano un cambio iniziale del supporto dopo 72 ore. Potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione di questo passaggio.
- Eseguire un cambio del terreno al 100% con MGM ogni 48-72 ore fino a quando le cellule sono confluenti all'80% (circa 5-7 giorni).
NOTA: Tutti i supporti devono essere riscaldati a 37 °C prima di cambiarli.
2. Isolamento delle cellule precursori degli oligodendrociti
Quando si placcano gli OPC dopo l'isolamento iniziale, devono essere placcati su una superficie rivestita di poli-D-lisina (piastra sterile o vetrino coprioggetti). Prepara questi materiali prima di completare questa sezione.
- Dopo 15 ore di agitazione, rimuovere il surnatante dai matracci e impiattare su una piastra di Petri sterile da 100 mm.
- Incubare il surnatante a 37 °C, 5% di CO2 per 30 minuti, agitando dopo 15 minuti per rimuovere le microglia rimanenti, poiché queste aderiranno molto rapidamente alla piastra. Per questa fase possono essere utilizzate piastre di Petri non trattate con coltura tissutale.
- Rimuovere il surnatante cellulare non aderente, contare e piastrare, su una superficie rivestita di poli-D-lisina. In genere, vengono placcati 7.500-10.000 OPC/cm2.
- Incubare a 37 °C, 5% di CO2 per almeno 1 ora (fino a 6 ore), quindi aspirare delicatamente il 95% del terreno e aggiungere lentamente terreni OPC caldi, pipettando i terreni contro la parete del pozzetto per ridurre al minimo l'interruzione degli OPC. Sostituire il supporto ogni 48 ore fino a quando le celle non sono pronte per l'uso.
NOTA: È fondamentale che venga cambiato un solo pozzetto alla volta. Gli OPC sono sensibili e particolarmente intolleranti alle condizioni di siccità. L'aggiunta di PDGF-AA nei terreni OPC ha lo scopo di ritardare la maturazione degli OPC in oligodendrociti. Questo fattore può essere escluso dai terreni di coltura se l'obiettivo sperimentale sono gli oligodendrociti maturi.
Tabella 1: Ricette di buffer e media.
Terreni di coltura misti (MGM)
| 88 ml | 1X DMEM (glicemia alta, con L-glutammina, con Na piruvato) |
| 10 ml | FBS inattivato a caldo |
| 1,0 ml | L-Glutammina (100X) |
| 1,0 ml | Antibiotico/Antimicotico |
Terreni OPC (50mL)
| 49 ml | Media neurobasale |
| 1,0 ml | Supplemento B27 (50X) |
| 10 ng/ml | PDGF-AA |
| NOTA: PDGF-AA viene aggiunto prima di ogni cambio di supporto. |