Una tecnica per generare organoidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Abstract

Fonte: Boisvert, E. M., et al. Un metodo statico autodiretto per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane. J. Vis. Exp (2020).

Questo video mostra una tecnica per generare organoidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane (hESC). La coltura aderente delle colonie di hESC viene trattata con enzimi per staccarle e romperle in grappoli. Questi cluster formano sfere tridimensionali in sospensione, che vengono poi indotte a differenziarsi in organoidi che imitano la corteccia cerebrale con strati di neuroni e cellule gliali.

Protocollo

1. Mantenimento delle cellule staminali

1. Mantenere le hESC H9 su uno strato di matrice della membrana basale a ridotto fattore di crescita (vedere la Tabella dei Materiali, d'ora in poi semplicemente indicata come matrice) secondo le istruzioni del produttore.
   1. Per rivestire una piastra a 6 pozzetti o una piastra da 10 cm, combinare 100 μl di matrice con 5,9 mL di terreno Eagle modificato (DMEM)/F12 ghiacciato di Dulbecco. Avvolgere le piastre in pellicola di paraffina e conservarle per una notte a 4 °C. Utilizzarle il giorno successivo per il passaggio delle cellule dopo l'aspirazione della matrice/terreno in ec....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supplemento B27	Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice 17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, Stati Uniti	PHG0263
Bsa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	Codice: A9647
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	Codice: 7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice 11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	10010023
Fattore di crescita Matrigel ridotto (matrice)	Corning, Corning, NY, Stati Uniti	356231
H9 hESC	WiCell, Madison, WI, Stati Uniti	WA09
eparina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	9041-08-01
L-glutammina	Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice 25030-081
Monotioglicerolo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	Codice: M6145
Supporti mTESR	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	Codice 85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, Stati Uniti	400-163
NEAA	Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice 11140-050
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	T8787-100ML
Palloni T75 con attacco ultra-basso	Corning, Corning, NY, Stati Uniti	Telefono 3814