Una tecnica per generare organoidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Abstract

Fonte: Boisvert, E. M., et al. Un metodo statico autodiretto per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane. J. Vis. Exp (2020).

Questo video mostra una tecnica per generare organoidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane (hESC). La coltura aderente delle colonie di hESC viene trattata con enzimi per staccarle e romperle in grappoli. Questi cluster formano sfere tridimensionali in sospensione, che vengono poi indotte a differenziarsi in organoidi che imitano la corteccia cerebrale con strati di neuroni e cellule gliali.

Protocollo

1. Mantenimento delle cellule staminali

1. Mantenere le hESC H9 su uno strato di matrice della membrana basale a ridotto fattore di crescita (vedere la Tabella dei Materiali, d'ora in poi semplicemente indicata come matrice) secondo le istruzioni del produttore.
   1. Per rivestire una piastra a 6 pozzetti o una piastra da 10 cm, combinare 100 μl di matrice con 5,9 mL di terreno Eagle modificato (DMEM)/F12 ghiacciato di Dulbecco. Avvolgere le piastre in pellicola di paraffina e conservarle per una notte a 4 °C. Utilizzarle il giorno successivo per il passaggio delle cellule dopo l'aspirazione della matrice/terreno in eccesso.
2. Coltura delle cellule di settimana in settimana con un rapporto di divisione di circa 1:12 ogni 7 giorni. Mantenere le cellule utilizzando il terreno mTESR-1 in un incubatore a 37 °C a basso contenuto di ossigeno (5% O₂, 5% CO₂). Aggiorna i contenuti multimediali ogni giorno. Eliminare le cellule differenzianti dalla coltura tra i passaggi utilizzando strumenti di vetro.
3. Le cellule H9 devono essere fatte passare da quattro a sei giorni prima di utilizzarle per produrre organoidi. Le cellule devono essere fatte passare con un rapporto di circa 1:8 di gruppi di cellule. Per fare ciò, iniziare risciacquando le cellule con la miscela di terreno/nutriente Eagle modificata di Dulbecco F-12 (DMEM/F12) e dissociare le cellule con una proteasi neutra (ad esempio, dispase, d'ora in poi indicata semplicemente come proteasi), risciacquare con DMEM/F-12 e lastra in 30-60 gruppi di cellule su 4 piastre (6 pozzetti o 10 cm) a ~20% di confluenza. Due giorni prima del raccolto, trasferirli in un'incubatrice normale (21% O₂, 5% CO₂). Le piastre dovrebbero raggiungere una confluenza del ~80% quando iniziano la formazione degli organoidi.

2. Dissociazione delle hESC per la coltura di organoidi

1. Aliquotare la soluzione madre di proteasi (5 U/mL).
   nota: In genere congeliamo aliquote da 1 mL a -20 °C per l'uso per diversi mesi.
2. Diluire la soluzione madre di proteasi alla concentrazione di lavoro aggiungendo 1 mL della soluzione madre più 5 mL di DMEM/F12 per ogni piastra da 6 pozzetti o 10 cm di hESC.
3. Aspirare e rimuovere i terreni di coltura cellulare, quindi coprire le hESC con la soluzione di proteasi. Mettere le piastre nell'incubatrice per 10-15 minuti o fino a quando i bordi delle colonie si arrotondano e iniziano a separarsi dalla matrice.
4. Inclinare la piastra, aspirare la soluzione di proteasi e lavare delicatamente le cellule con DMEM/F12 tre volte. Utilizzare 2 ml/pozzetto per ogni lavaggio quando si utilizza una piastra a 6 pozzetti e 6 ml quando si utilizza una piastra da 10 cm. Assicurati che le colonie rimangano attaccate alla matrice quando esegui questo passaggio.
5. Aggiungere circa 1,5 mL di terreno mTESR fresco a ciascun pozzetto (o 5 mL per una piastra da 10 cm) e sciacquare le cellule dalla piastra utilizzando un pipettaggio delicato.
6. Utilizzando una pipetta da 10 ml, aspirare delicatamente ed erogare le hESC all'interno della piastra fino a raggiungere circa 1/30 della loro dimensione originale. I cluster di colonie dovrebbero assomigliare a quadrati di dimensioni ~250-350 μm al completamento di questi passaggi.

3. Generazione di organoidi

1. Trasferire le cellule in un singolo pallone T75 a bassissimo attacco contenente 30 mL di terreno mTESR senza fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF).
2. Il giorno successivo, inclina il pallone in modo che le cellule vive si accumulino nell'angolo (questo potrebbe richiedere 5-10 minuti il primo giorno, ma diventerà più veloce man mano che i grappoli diventano più grandi).
   nota: Se in questa fase o in qualsiasi fase successiva è presente un gran numero di cellule che hanno aderito al fondo del pallone, trasferire le cellule in un nuovo pallone. È normale avere un'elevata popolazione di cellule morte per i primi due giorni. Quando si eseguono le sostituzioni dei supporti, assicurarsi di rimuovere il più possibile i detriti cellulari.
3. Una volta che le cellule si sono depositate, aspirare il terreno e le cellule morte, lasciando circa 10 ml di terreno contenente le cellule vive.
4. Aggiungere ~20 mL di terreno a basso contenuto di bFGF (DMEM/F12 integrato con 1x N2, 1x B27, 1x L-glutammina, 1x aminoacido non essenziale (NEAA), 0,05% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,1 mM di monotioglicerolo (MTG) integrato con 30 ng/mL di bFGF).
5. Controlla le celle il giorno 2. Se la maggior parte delle cellule appare sana e luminosa, non c'è bisogno di fare nulla. Tuttavia, se più di un terzo delle cellule appare scuro, sostituire il terreno (utilizzando la stessa tecnica di inclinazione del passaggio 3.2) con ~20 mL di terreno a basso bFGF integrato con 20 ng/mL di bFGF.
6. Il giorno 3, sostituire metà del terreno (utilizzando la tecnica di inclinazione al punto 3.2) con 20 mL di terreno a basso bFGF integrati con 10 ng/mL di bFGF.
7. Il giorno 5, sostituire metà del terreno (utilizzando la tecnica di inclinazione al passaggio 3.2) con 20 ml di terreno di induzione neurale (NIM: DMEM/F12, 1x integratore di N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL di eparina).
   nota: Se ci sono grandi ammassi di cellule o organoidi molto più grandi degli altri, dovrebbero essere rimossi dalla coltura. Le dimensioni sono stimate dall'aspetto al microscopio; ad esempio, utilizzando un oculare con reticolo. La maggior parte degli organoidi ha dimensioni simili (circa 100 ± 20 μm). Abbiamo rimosso gli organoidi che erano circa 2 volte più piccoli o più grandi degli altri.
8. Sostituire metà del terreno (~15 mL) (utilizzando la tecnica del tilting) con NIM a giorni alterni.
9. Dopo 3 settimane di coltura, aggiungere 100 volte la penicillina/streptomicina al terreno di coltura (NIM: DMEM/F12, 1 integratore di N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml di eparina) a una concentrazione finale di 1 volta, se lo si desidera. Aggiorna i file multimediali a giorni alterni.
   nota: In questo modo, abbiamo mantenuto gli organoidi per un massimo di 6 mesi in coltura.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supplemento B27	Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice 17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, Stati Uniti	PHG0263
Bsa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	Codice: A9647
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	Codice: 7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice 11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	10010023
Fattore di crescita Matrigel ridotto (matrice)	Corning, Corning, NY, Stati Uniti	356231
H9 hESC	WiCell, Madison, WI, Stati Uniti	WA09
eparina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	9041-08-01
L-glutammina	Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice 25030-081
Monotioglicerolo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	Codice: M6145
Supporti mTESR	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	Codice 85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, Stati Uniti	400-163
NEAA	Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice 11140-050
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	T8787-100ML
Palloni T75 con attacco ultra-basso	Corning, Corning, NY, Stati Uniti	Telefono 3814