1. Dissezione ventrale del mesencefalo e del midollo spinale
NOTA: Esegui tutti i seguenti passaggi tranne i passaggi 1.1.1−1.1.3 e 1.1.5−1.1.6 sotto uno stereomicroscopio a dissezione a fluorescenza. Il tempo totale di dissezione per esperimento è in genere di 3-5 ore, a seconda della competenza nella tecnica di dissezione e del numero di motoneuroni necessari per ogni esperimento.
- Dissezione mesencefalica ventrale
- Eutanasia di una topolina gravida circa 11,5 giorni dopo la fecondazione mediante anidride carbonica e lussazione cervicale.
- Spruzzare accuratamente l'addome con etanolo e rimuovere l'utero utilizzando forbici sterili per micro dissezione e pinze per medicazione per il pollice. Lavare brevemente l'utero con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), quindi trasferirlo nella piastra di dissezione riempita con PBS sterile preraffreddato.
- Rimuovere accuratamente gli embrioni positivi IslMN:GFP (Islet motor neuron: green fluorescent protein) dall'utero utilizzando forbici sterili per micro dissezione, pinze per medicazione per il pollice e pinzette Dumont #5 in soluzione salina sterile con tampone con fosfato (PBS) ghiacciata sotto la luce intensa del microscopio. Utilizzando un cucchiaio miniforato sterile Moria, trasferire ogni embrione in un pozzetto separato di una piastra a 24 pozzetti riempita con terreno prerefrigerato Hibernate-E a bassa fluorescenza integrato con 1x B27. Mantenere la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio.
- Trasferisci un embrione in una piastra di dissezione sterile e coprilo completamente con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) sterile
ghiacciata.
- Assicurarsi che le fasi di dissezione vengano eseguite sotto l'illuminazione del microscopio con isotiocianato di fluoresceina (FITC). Usando una pinzetta, rimuovere la coda e la faccia dell'embrione senza danneggiare il mesencefalo (Figura 1Ba). Posizionare l'embrione prono con gli arti a cavalcioni sotto e la coda rivolta verso la parte anteriore del microscopio, verso il dissettore (indicato da un asterisco, Figura 1Bb).
- Usando una pinzetta, apri il tetto del quarto ventricolo per generare una piccola apertura. Usa questa apertura per agganciare le pinzette nello spazio creato tra il quarto ventricolo e il suo tetto. Sezionare lungo la superficie dorsale dell'embrione rostrale alla corteccia e lateralmente alla piastra del pavimento e alla colonna motoria (Figura 1Ca, b). Aprire il tessuto sezionato a libro aperto per rivelare i nuclei del neurone oculomotore GFP-positivo (nervo cranico 3 [CN3]) e del neurone trocleare (nervo cranico 4 [CN4]><).
NOTA: Un piccolo pezzo di tessuto del mesencefalo ventrale contenente mesenchima, CN3 e CN4 sarà ora esposto.
- Separare con cura il mesencefalo ventrale dall'embrione e rimuovere il tessuto meningeo usando una pinzetta e un coltello da micro dissezione. Sezionare i nuclei bilaterali CN3 e CN4 GFP-positivi lontano dalla piastra di base e da altri tessuti circostanti GFP-negativi utilizzando una pinzetta e un micro coltello da dissezione (Figura 1D). Massimizzare il numero di motoneuroni GFP-positivi nel tessuto asportato, ma evitare di toccarli o danneggiarli.
- Se si desidera un insieme di nuclei CN3 e CN4 separati, tagliare lungo la linea mediana di questi due nuclei (linea tratteggiata gialla nella Figura 1D). Utilizzando una pipetta P1000, raccogliere il tessuto mesencefalico ventrale sezionato con una minima HBSS e posizionarlo in una provetta per microcentrifuga da 1,7 ml etichettata riempita con terreno di dissezione. Conservare in ghiaccio fino alla dissociazione.
- Continuare a raggruppare i mesencefali ventrali da embrioni aggiuntivi nella stessa provetta fino a quando il numero totale soddisfa i requisiti sperimentali (fare riferimento al passaggio 4 per il numero ideale di cellule).
NOTA: Si raccomanda una raccolta aggregata di almeno 10 mesencefali ventrali che producono circa 1 x 104 motoneuroni CN3/CN4 perché i tessuti sono soggetti a stress durante la dissociazione e lo smistamento.
- Dissezione ventrale del midollo spinale
- Tenere l'embrione prono con la testa rivolta verso la parte anteriore del microscopio, verso il dissettore. Tenere l'embrione con un paio di pinzette e inserire la punta dell'altro paio di pinzette nella parte caudale non aperta del quarto ventricolo.
- Aprire il resto del rombencefalo e del midollo spinale dorsalmente su tutta l'estensione rostrocaudale dell'embrione. Aprire tagliando il tessuto dorsale, partendo dal quarto ventricolo e procedendo verso il canale centrale del midollo spinale caudale utilizzando le pinze come forbici (Figura 1Ca,b). Fare attenzione a non toccare o danneggiare il midollo spinale ventrale durante questa procedura.
- Tenere l'embrione con un paio di pinzette e pizzicare il lembo del tessuto dorsale su ciascun lato con l'altro paio di pinzette (Figura 1Ea,b).
NOTA: I tessuti dorsali asportati contengono pelle dorsale, mesenchima, gangli della radice dorsale (DRG), romboencefalo dorsale e midollo spinale. Rimuovere il più possibile questi tessuti senza danneggiare i nuclei del motoneurone spinale (SMN), perché sono adesivi e possono intrappolare gli SMN durante il filtraggio o causare l'intasamento durante lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS).
- Rimuovere il midollo spinale ventrale utilizzando il coltello da microdissezione per perforare direttamente sotto l'SMN GFP-positivo. Sollevare il midollo spinale ventrale con movimenti simili a seghe su entrambi i lati (Figura 1Fa, b). Tagliare il midollo spinale ventrale fluttuante trasversalmente direttamente sopra C1, dove sporge il primo corno anteriore positivo alla GFP (Figura 1G). Inoltre, tagliare trasversalmente al limite superiore dell'arto inferiore (Figura 1G). Rimuovere la porzione cervicale (C1)-lombare (L2-L3) del midollo spinale ventrale dopo questa procedura.
- Posizionare il midollo spinale ventrale con il lato dorsale rivolto verso l'alto e tenerlo premuto premendo il tessuto GFP-negativo tra le colonne SMN GFP-positivo con un paio di pinzette. Rimuovere il mesenchima attaccato rimanente, i DRG e il midollo spinale dorsale tagliando entrambi i lati della colonna SMN GFP-positiva con il coltello per microdissezione (Figura 1H). Fai attenzione a massimizzare i motoneuroni GFP-positivi senza danneggiarli.
- Utilizzando una pipetta P1000, raccogliere il tessuto ventrale del midollo spinale sezionato con HBSS minimo e inserirlo nella provetta per microcentrifuga da 1,7 ml marcata con SMN riempita con terreno di dissezione. Conservare in ghiaccio fino alla dissociazione. Continuare a raggruppare il midollo spinale ventrale da ulteriori embrioni nella stessa provetta fino a quando il numero totale soddisfa i requisiti sperimentali.
nota: Si raccomanda di raccogliere almeno tre midollo spinale ventrale che producano circa 2,1 x 104 SMN perché i tessuti sono soggetti a stress durante la dissociazione e lo smistamento.
- Raccogli i motoneuroni facciali e le estremità degli embrioni di topo IslMN:GFP come controlli GFP-positivi e GFP-negativi per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS), rispettivamente. Le estremità sono GFP-negative perché gli assoni GFP-positivi degli SMN non si sono ancora estesi alle estremità a questa età embrionale.
2. Dissociazione tissutale
NOTA: Il tempo totale di dissociazione è tipicamente di 1,5 ore per esperimento.
- La soluzione calda di papaina e inibitore dell'albumina-ovomucoide aliquota a 37 °C 30 minuti prima della dissociazione.
- Far girare brevemente i tessuti micro sezionati a bassa velocità.
- Utilizzando una pipetta P100, rimuovere con cura la quantità possibile di ibernazione E senza aspirare i tessuti.
NOTA: Assicurarsi di rimuovere tutto il residuo di ibernazione E dopo questo passaggio per evitare di ridurre l'efficacia della dissociazione della papaina nel passaggio successivo.
- Aggiungere il volume appropriato di soluzione di papaina (Tabella 1) a ciascuna delle provette per microcentrifuga da 1,7 mL contenenti i campioni di tessuto microdissezionati.
NOTA: Il volume appropriato di papaina per la dissociazione è stato determinato al fine di massimizzare la dissociazione efficace riducendo al minimo lo stress sulle cellule.
- Triturare delicatamente 8 volte con una pipetta P200. Eseguire delicatamente tutte le fasi di triturazione per preservare la vitalità dei motoneuroni.
- Incubare le provette contenenti i tessuti per 30 minuti a 37 °C, agitando con un dito 10 volte ogni 10 minuti. Triturare delicatamente ogni sospensione 8 volte con una pipetta P200 dopo l'incubazione. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min.
- Per garantire l'efficacia dell'inibizione degli ovomucoidi nella fase successiva, utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere ed eliminare la maggior quantità possibile di surnatante senza aspirare i tessuti.
- Risospendere i pellet nel volume appropriato di soluzione di inibitore dell'albumina-ovomucoide (Tabella 1) triturando delicatamente 8 volte con una pipetta P200.
- Attendere 2 minuti per consentire a eventuali pezzi rimanenti di tessuto non dissociato di depositarsi sul fondo della provetta.
- Raccogliere la maggior quantità possibile di surnatante senza aspirare i tessuti non dissociati utilizzando una pipetta P200. Trasferire il surnatante in provette da microcentrifuga fresche da 1,7 mL.
- Se alcuni pezzi di tessuto rimangono indissociati dopo il passaggio 2.10, ripetere i passaggi 2.8-2.10 per i tessuti non dissociati che rimangono nelle provette per microcentrifuga originali da 1,7 mL per massimizzare la resa finale delle cellule dissociate riducendo al minimo lo stress sulle cellule dissociate in precedenza, contenuto nel surnatante del passaggio 2.10.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti. Rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta P1000.
- Risospendere il pellet nel volume appropriato di terreno di dissezione (Tabella 1) pipettandolo 8 volte con una pipetta P1000. Il volume appropriato della sospensione finale è stato determinato in modo che la densità cellulare non superi i 10-7 cellule/mL, che può bloccare il flusso della macchina per citometria a flusso, ma anche in modo che le cellule non siano eccessivamente diluite, il che si traduce in un rallentamento della velocità di selezione.
- Filtrare le sospensioni attraverso filtri cellulari da 70 μm per eliminare eventuali grumi di grandi dimensioni o tessuto non digerito. Trasferire le sospensioni in provette di polistirene a fondo tondo da 5 ml e conservarle in ghiaccio fino al momento del bisogno.
3. Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)
NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando un selezionatore FACS dotato di un laser viola da 15 mw 405 nm, un laser blu da 100 mw 488 nm, un laser arancione da 75 mw 594 nm e un laser rosso da 40 mw 640 nm. Le cellule sono state selezionate come fluido di guaina in PBS sterile in condizioni asettiche attraverso un ugello da 100 μm. Al fine di ridurre al minimo lo stress delle celle, la velocità di flusso è stata impostata su una pressione del campione di 1-3, in modo tale da acquisire un massimo di 1.000-4.000 eventi al secondo. Il tempo totale di FACS è in genere di 1-2 ore per esperimento.
- Impostare le tensioni per la diffusione diretta e laterale in modo che la popolazione cellulare possa essere visualizzata correttamente. L'impostazione delle tensioni appropriate per lo smistamento delle celle è complessa e richiede un operatore FACS esperto.
- Per distinguere le diverse popolazioni cellulari, tracciare le cellule in base alle dimensioni determinate dall'area di dispersione diretta (FSC-A) rispetto alla complessità interna determinata dall'area di dispersione laterale (SSC-A). Disegna un cancello attorno alle celle vive come indicato nella Figura 2Aa e nella Figura Ba per escludere detriti e celle morte. Raggruppa le celle all'interno della gated region come popolazione 1 (P1).
- Per escludere aggregati di cellule e doppietti, tracciare successivamente le celle P1 in base alla Side Scatter Width (SSC-W) rispetto all'SSC-A. Porta la popolazione di singole celle come popolazione 2 (P2) (Figura 2Ab e Figura Bb).
- Tracciare le celle P2 in base alla larghezza di dispersione diretta (FSC-W) rispetto all'FSC-A e selezionare la popolazione di singole celle come popolazione 3 (P3) (Figura 2Ac e Figura Bc).
nota: L'uso di due gate consecutivi in 3.3 e 3.4 esclude i gruppi cellulari e i doppietti (FSC-W alto e FSC-A alto).
- Cellule Gate P3 basate su GFP rispetto alloficocianina (APC). Il canale APC rileva l'autofluorescenza. Il gating su questo canale evita di catturare le celle autofluorescenti. Utilizzare celle GFP-negative per regolare la tensione per i canali fluorescenti FITC/GFP. Idealmente, posizionare i cancelli per queste popolazioni cellulari intorno a 102. Selezionare le soglie di gate per la popolazione GFP-positiva 4 (P4) individualmente per ciascun tipo di motoneurone (Figura 2Ad e Figura Bd).
NOTA: Impostare il gate GFP molto più alto per gli SMN rispetto ai CN3/CN4 per ottenere una coltura pura (Figura 2Ad e Figura Bd). Un gate GFP più basso per le colture SMN porta alla contaminazione delle colture da parte della glia e dei neuroni non motori. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che c'è un basso livello di espressione di GFP in alcune gliali e neuroni non motori a causa di un promotore permeabile. La percentuale di cellule GFP-positive rispetto alle cellule totali è tipicamente dello 0,5-1,5% per CN3/CN4 e dell'1,5-2,5% per gli SMN. Se la dissezione ha avuto successo, questi numeri possono essere utilizzati come punto di riferimento per determinare la posizione appropriata per il gate positivo alla GFP (Figura 2Ae e Figura Be).
- Eseguire il FACS secondo il protocollo del produttore. Raccogliere le cellule P4 in provette per microcentrifuga fresche da 1,7 mL riempite con 500 μL di terreno di coltura per motoneuroni. Conservare in ghiaccio fino alla placcatura.
nota: Sebbene le cellule possano essere smistate direttamente nei pozzetti, ciò si traduce in un numero dispari di cellule per pozzetto. Smistare le cellule in provette per microcentrifuga da 1,75 mL e quindi piastrarle manualmente per ottenere una distribuzione più uniforme della piastra.
4. Coltura di motoneuroni primari purificati
- Sospensioni CN3/CN4 e SMN isolate da FACS con terreno di coltura di motoneuroni preriscaldato a 37 °C a densità di 5 x 103 e 1 x 104 cellule/mL, rispettivamente.
nota: Un embrione E11.5 produce circa 1 x 103 CN3/CN4 e 7 x 103 SMN. Tuttavia, queste rese dipendono fortemente dalla purezza dei tessuti sezionati, dalla completezza della dissociazione cellulare e dall'appropriata soglia delle porte GFP durante la FACS.
- Trasferire piastre da 96 pozzetti prerivestite con poli-D-lisina (PDL) e laminina dall'incubatore per colture tissutali a 37 °C alla cappa a flusso laminare e aspirare la laminina da ciascun pozzetto. Utilizzare immediatamente piastre e vetrini coprioggetti senza lavarli.
- Aggiungere 200 μl di sospensioni diluite di CN3/CN4 e SMN in ciascun pozzetto di piastre da 96 pozzetti rivestite di PDL/laminina. Le densità finali delle celle dovrebbero essere rispettivamente di 1 x 103 e 2 x 103 cellule/pozzetto per CN3/CN4 e SMN.
nota: La densità iniziale di placcatura degli SMN in piastre a 96 pozzetti (2 x 10,3 cellule/pozzetto) è doppia rispetto a quella di CN3s/CN4s (1 x 10,3 cellule/pozzetto) al fine di ottenere un numero e una densità di motoneuroni finali simili a 2 e 9 giorni in vitro (DIV) (4-6 x 102 e 2-4 x 102 cellule per pozzetto), rispettivamente).
- Coltura di neuroni in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2.
- Alimentare i neuroni ogni 5 giorni rimuovendo metà del vecchio terreno (100 μL) e sostituendolo con lo stesso volume di terreno di coltura fresco per motoneuroni. Assicurarsi che i processi neuronali diventino visibili su 1 DIV e diventino più spessi e più lunghi di 14 DIV (Figura 3). I corpi cellulari neuronali si ingrandiscono e tendono ad aggregarsi in colture a lungo termine, in particolare per gli SMN (Figura 3).
NOTA: Eseguire tutte le modifiche al terreno e alla soluzione lasciando metà del volume originale del terreno per evitare il distacco delle cellule in coltura. Ciò include le fasi di fissazione e immunocitochimica (ICC). Se tutti i terreni vengono rimossi, indipendentemente dalla delicatezza, la maggior parte delle cellule si staccherà e verrà lavata via.
