1. Configurazione iniziale
- Impostazione delle concentrazioni di gas e temperatura
- Utilizzando il software, fare clic sulla scheda "Ospite" nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia grafica. Accedi al sistema utilizzando un nome utente e una password designati. Assicurati che ogni utente abbia il proprio nome utente e password.
- Fare clic su un modulo per regolare (Figura 1). All'interno della nuova finestra che mostra le impostazioni correnti, fare clic sul valore del set point O2 esistente sotto "Set point" e inserire il livello di concentrazione O2 richiesto per questo modulo. Inserire il 5% di O2 se le cellule staminali pluripotenti verranno coltivate o manipolate in questo modulo e il 9% di O2 se le cellule staminali neurali verranno coltivate o manipolate. Fare clic sul segno di spunta verde per confermare il set point.
nota: Due moduli non sono regolabili in gas: la cappa laminare e la camera del microscopio. Le concentrazioni di gas nella cappa a flusso laminare sono atmosferiche, mentre quelle nella camera di processo mantengono passivamente quelle nella camera del microscopio.
- Ripetere questo passaggio per CO2. Inserire un set point del 5% di CO2 per tutti i moduli, ad eccezione delle camere tampone, che si regolano solo per O2.
- Monitora le attuali concentrazioni di gas etichettate come "valori di processo" per assicurarti che raggiungano i nuovi punti di regolazione.
- Regolare i setpoint del gas di tutti i moduli sui valori appropriati. Abbina i livelli di CO2 e O2 delle camere che saranno esposte l'una all'altra. Ad esempio, è possibile regolare la camera di processo al 5% di O2 prima di aprire un incubatore che sviluppa cellule al 5% di O2. Inoltre, passare al 5% di O2 in qualsiasi camera tampone utilizzata per aggiungere elementi alla camera di processo durante questo periodo.
- Impostare la temperatura della camera di processo a 37 °C utilizzando la stessa schermata per le regolazioni del gas. Inoltre, la temperatura del pavimento della camera di processo deve essere impostata su 37 °C.
- Fare clic sul modulo di incubazione banchi sotto ogni incubatore. Regolare la temperatura dei banchi a 37 °C.
- Funzionamento delle camere tampone
- Raccogli tutte le forniture necessarie per l'attività data (alimentazione, spaccatura, colorazione, ecc.) all'inizio per evitare ritardi nel flusso di lavoro. Spruzzare abbondantemente tutti i materiali con etanolo al 70% e lasciarli asciugare nella cappa laminare. Non spruzzare fiasche o piastre di cellule: pulirle delicatamente con una spugna di garza sterile imbevuta di etanolo al 70%.
- Assicurarsi che le porte esterna e interna della camera tampone siano ben chiuse. Quindi, apri la porta esterna e posiziona gli oggetti all'interno.
- Chiudere lo sportello esterno. Selezionare il modulo buffer all'interno del software e fare clic sulla scheda del fattore di diluizione. Inseriscine uno nella casella del fattore logaritmico. Fare clic su start.
Nota: un "fattore di diluizione" significa che l'atmosfera del modulo tampone verrà evacuata e sostituita una volta con gas pulito filtrato HEPA.
- Una volta che l'interfaccia grafica smette di lampeggiare "fattore di diluizione", aprire lo sportello interno della camera tampone e portare i materiali all'interno della camera di processo><.
Attenzione: Non permettere che la porta interna ed esterna vengano aperte contemporaneamente e non aprire la porta interna se la camera tampone non ha subito un fattore di diluizione.
- Innanzitutto, rimuovere gli elementi dalla camera di processo e assicurarsi che la camera tampone sia stata sottoposta a un fattore di diluizione. Quindi, aprire lo sportello interno, posizionare gli oggetti da rimuovere all'interno e chiudere lo sportello interno. Quindi, apri lo sportello esterno e rimuovi gli oggetti.
Nota: Non è necessario eseguire un fattore di diluizione prima di aprire lo sportello esterno.
2. Introduzione e alimentazione delle cellule
- Configurazione dell'incubatrice
- Metti 3 piastre di Petri nella vaschetta dell'acqua alla base di ogni incubatrice. Riempi questi piatti con acqua sterile, non riempiendo direttamente la padella. Mantenere il livello dell'acqua in queste stoviglie, poiché sono fondamentali per mantenere il set point di umidità relativa (RH) delle incubatrici.
- All'interno dell'interfaccia grafica, fare clic sull'incubatrice. Sotto il set point, fare clic sul valore di umidità relativa (UR) esistente e inserire 85%. Fare clic sul segno di spunta verde per accettare questo valore.
- Preparazione dell'impianto di produzione di celle per le celle
- Se non è già stato fatto, regolare le camere tampone, la camera di processo e un incubatore in base ai set point del gas richiesti per il tipo di cella da introdurre.
- Pulire la superficie della camera di processo con una garza sterile e un disinfettante non infiammabile. Non utilizzare disinfettanti a base di acido peracetico; In un sistema chiuso, i vapori forti e persistenti sono tossici per le cellule dei mammiferi. Utilizzare invece prodotti a base di benzalconio cloruro.
- Continua a disinfettare. Pulisci i guanti e le superfici comunemente toccate, come le maniglie delle porte. Utilizzare il disinfettante accuratamente ma con parsimonia, poiché il liquido in eccesso nella camera di processo contribuirà all'umidità, alla condensa e alla possibile crescita microbica.
- Pulire la superficie della cappa a flusso laminare e della camera tampone con etanolo al 70% e lasciarla asciugare. Posizionare il pallone o la piastra di cellule (nel nostro caso, PSC (cellule staminali pluripotenti) o NSC (cellule staminali neurali)) nella cappa e pulirne brevemente la superficie esterna con una spugna di garza sterile imbevuta di etanolo.
- Mettere il pallone o la piastra nella camera tampone ed eseguire un fattore di diluizione (passaggio 1.2.3).
- Al termine del fattore di diluizione, spostare immediatamente il pallone o la piastra nell'incubatore appropriato. Poiché gli incubatori si trovano sul retro della camera di processo, estrarre un ripiano nella camera di processo per il posizionamento delle celle. Evitare di aprire le porte dell'incubatore inutilmente o per periodi prolungati, poiché l'aria della camera di processo è molto secca rispetto a quella degli incubatori e comporterà una significativa perdita di umidità nell'incubatore.
- Alimentazione di colture cellulari
- Raccogli i componenti del mezzo, come pipette sierologiche, un pipettatore elettronico, una garza e un disinfettante. Inoltre, raccogli un contenitore di scarto per il terreno di coltura cellulare esaurito, ma non riempirlo di candeggina. Portare i materiali nella camera di processo attraverso una camera tampone come descritto nella Sezione 1.2. Disporre i materiali in modo da garantire uno spazio di lavoro ottimale. Evitare di posizionare gli oggetti non utilizzati al centro della camera di processo.
- Lasciare il contenitore del terreno leggermente aperto per consentire al fluido di equilibrarsi con i livelli di CO2 e O2 presenti all'interno del sistema. Alcuni produttori di mezzi PSC indicano di non riscaldare i fluidi a 37 ºC; In tal caso, utilizzare una camera tampone per equilibrare il fluido. Lasciare equilibrare il prodotto per 20 minuti.
- Rimuovere il vecchio terreno dai pozzetti utilizzando un'apposita pipetta stereologica e un pipettatore elettronico. Per le PSC, rimuovere tutta la quantità rimanente del vecchio terreno per evitare l'essiccazione durante il processo di alimentazione. Per le NSC, rimuovere metà del vecchio terreno. Versare i rifiuti nel contenitore dei rifiuti.
- Riposizionare la pipetta usata nell'involucro originale e spostarla sul lato della camera di processo o in una camera tampone designata per la rimozione dei rifiuti. Con una pipetta sierologica sterile fresca, aggiungere un terreno fresco alle piastre per colture cellulari e riposizionare le piastre nell'incubatore designato.
- Al termine dell'alimentazione, spruzzare una garza con disinfettante e pulire accuratamente il pavimento e le maniglie delle porte della camera di processo. Se nel sistema vengono coltivate più linee cellulari, sterilizzare tra l'alimentazione di ciascuna linea cellulare. Questo aiuta a ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata.
- Al termine, rimuovere i rifiuti o altri oggetti non necessari attraverso una delle camere tampone.
3. Dividere le colture cellulari
- Passaging enzimatico di PSC o NSC
- Raccogli tutti gli oggetti necessari per il passaggio. Ciò include terreni, tamponi di dissociazione cellulare enzimatica o non enzimatica (quest'ultimo è solo per NSC), DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco), piastre o fiasche, matrice extracellulare (ECM), tubi conici e pipette sierologiche. Portarli nel sistema utilizzando una camera tampone.
- Rivestire piastre o matracci freschi con ECM, come descritto in precedenza 9,10. Alcune ECM, come quelle derivate da linee cellulari di sarcoma di topo, sono liquide solo tra 4 e 15 °C, quindi utilizzare un blocco freddo sterilizzato o un impacco di ghiaccio in gel per mantenere fredda la ECM mentre si lavora nella camera di processo riscaldata.
- Estrarre il terreno esaurito dalla coltura e smaltirlo nel contenitore dei rifiuti.
- Sciacquare il pozzetto o la superficie del pallone con 1 ml di DPBS/ pozzetto e smaltire il DPBS.
- Aggiungere 1 - 2 ml di enzima caldo in ogni pozzetto. Solo le colture molto dense richiedono 2 ml.
- Spostare immediatamente il piatto di coltura o il pallone nella camera del microscopio e osservare la coltura. Fai attenzione ai segni di singole cellule che iniziano ad allentarsi dal piatto. Non aspettare che le celle galleggino in sospensione prima di procedere alla fase successiva.
- Riportare le celle nella camera di processo principale. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, aggiungere 4 ml di DPBS per ogni 1 ml di enzima, quindi pipettare con forza su e giù per rimuovere le cellule dalla superficie del pozzetto. Se si passano più pozzetti all'interno di una piastra a parete multipla, aggiungere il DPBS a ciascun pozzetto prima di rimuovere le celle dai singoli pozzetti.
- Trasferire l'enzima e la sospensione cellulare di PBS in una provetta conica di dimensioni adeguate.
- Se una centrifuga non è disponibile nell'impianto di produzione di celle, sigillare ermeticamente il tubo conico, posizionarlo in una camera tampone e sigillare lo sportello chiuso.
- Rimuovere il tubo conico dalla camera tampone dal lato del flusso laminare e far girare le celle a 100 x g per 5 minuti a RT.
- Spruzzare il tubo conico con etanolo al 70% e portarlo nella camera di processo utilizzando una camera tampone e un fattore di diluizione.
- Pipett dal surnatante e risospendere le cellule in 2 ml di PSC o NSC. In caso di passaggio di PSC, includere l'inibitore ROCK (proteina chinasi associata a Rho) nel terreno a una concentrazione di 10 μM.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e determinare i pozzetti o le piastre necessari. PSC su piastra a 5 x 104 - 1 x 105 celle/cm2. Suddividere le NSC con un rapporto 1:2.
Nota: le NSC spesso si aggregano e resistono a un conteggio accurato in un emocitometro.
- Se è necessaria la crioconservazione delle cellule, assicurarsi che tutti i materiali di consumo e i mezzi di congelamento siano preparati e collocati all'interno della camera di processo. Il DMSO (dimetilsolfossido) è molto tossico per le cellule a 37 ºC, quindi agisce rapidamente. Conservare il contenitore di congelamento rivestito di isopropanolo a RT nella cappa a flusso laminare. Una volta riempite e sigillate le fiale di crioconservazione, rimuoverle immediatamente dalla camera di processo facendole passare attraverso una camera tampone.
- Passaggio manuale di PSC
- Verificare che le impostazioni cultura debbano essere passate, come descritto in precedenza. In tal caso, preparare piastre o fiasche fresche rivestite con matrice extracellulare. Quindi, cambia completamente il mezzo.
- Pulire la camera del microscopio con una garza sterile inumidita con una quantità sufficiente di disinfettante non infiammabile: una quantità eccessiva provocherà un appannamento eccessivo. Pulisci solo i guanti, la superficie del pavimento e il palco. Introdurre nella camera diversi puntali per pipette da 200 μl o 1.000 μl confezionati singolarmente.
- Portare la piastra di PSC nella camera del microscopio, rimuovere il coperchio e posizionarla a faccia in giù sul pavimento appena pulito. Lasciare il coperchio sollevato espone la parte inferiore direttamente alle correnti d'aria e alla potenziale contaminazione.
- Scartare la punta di una pipetta e, utilizzando il microscopio per visualizzare la coltura, selezionare le colonie con una buona morfologia utilizzando la punta della pipetta.
Nota: il puntale della pipetta può essere attaccato a una pipetta se il singolo utente lo trova più comodo.
- Riposizionare il coperchio sulla piastra e riportare la piastra nella camera di processo.
- Elimina l'ECM in eccesso dalla nuova piastra e trasferisce il terreno dalla vecchia piastra (contenente i pezzi di colonia in sospensione) alla nuova piastra. Se il vecchio piatto contiene ancora colonie che non sono pronte per essere raccolte, nutri anche quelle.
