La linea di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), HPS1006, è stata fornita dal RIKEN BRC attraverso il National Bio-Resource Project del MEXT/AMED, Giappone.
1. Induzione della differenziazione di hiPSC in cellule progenitrici endoteliali (EPC)
- Piastre e reagenti rivestiti di matrice extracellulare (ECM)
- Preparare piastre a 12 pozzetti rivestite con matrice di membrana basale aliquotando 2,5 mg di gel di matrice in provette da centrifuga da 50 mL per la conservazione a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Aggiungere nella provetta 30 ml di miscela fredda F-12 (DMEM/F12) di Eagle's Medium/Nutrient modificata di Dulbecco, conservata in frigorifero a 4 °C. Miscelare delicatamente pipettando fino a scongelare il gel, quindi aggiungere 500 μl di soluzione a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Porre la piastra in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2) per almeno 1 h.
nota: Il gel della matrice della membrana basale è sensibile alla temperatura e deve essere maneggiato secondo le istruzioni del produttore per l'aliquotazione e il rivestimento delle piastre. La concentrazione di proteine della matrice extracellulare può variare tra i lotti. Per garantire l'accuratezza, la concentrazione esatta deve essere indicata sulla scheda del certificato di qualità per il lotto specifico, utilizzando il numero di lotto. Ad esempio, se la concentrazione esatta è di 10,0 mg/mL, utilizzare 250 μL di gel per un totale di 2,5 mg.
- Preparare la soluzione madre dell'inibitore della rho-chinasi (ROCK) sciogliendo l'inibitore ROCK in acqua sterile a una concentrazione di 10 mM (Tabella 1). Aliquotare la soluzione madre in volumi di 100-200 μl e conservarla a -20 °C per evitare cicli di gelo-scongelamento.
- Preparare una soluzione madre da 100 mg/mL di acido L-ascorbico sciogliendo 5 g di acido L-ascorbico in 50 mL di acqua sterile e conservare a -20 °C (Tabella 1). Aggiungere 6,25 mL di glutammina e 305 μL di soluzione madre di acido L-ascorbico in 500 mL di DMEM/F12 avanzato per ottenere un terreno LaSR (Tabella 1). Conservare a 2-8 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare CHIR99021 soluzione sciogliendo CHIR99021 in dimetilsolfossido (DMSO) non diluito fino a una concentrazione finale di 10 mM (Tabella 1). Aliquotare la soluzione in volumi di 100-200 μL per evitare cicli di gelo-scongelamento e conservare a -20 °C per un massimo di 1 anno. Conservare le aliquote di lavoro della soluzione madre a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Preparare il terreno DMEM/F12-10 aggiungendo 50 mL di siero fetale bovino inattivato termicamente a 450 mL di DMEM/F12. Conservare il terreno a 2-8 °C per un massimo di 1 mese (Tabella 1).
- Preparare il tampone di flusso-1 aggiungendo 33,3 mL di albumina sierica bovina (BSA) al 7,5% a 467 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di Dulbecco (Tabella 1). Conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Seeding di hiPSC singolarizzate ed espansione per il differenziamento delle EPC (dal giorno -3 al giorno -1)
- Iniziare la differenziazione quando le colonie di hiPSC in una piastra a 6 pozzetti non mostrano alcuna differenziazione spontanea e hanno la densità appropriata per il passaggio, in genere intorno all'80% di confluenza (2,5-3,5 x 106 cellule). Monitorare attentamente le cellule spontaneamente differenziate al microscopio per assicurarsi se sono necessari più passaggi per eliminare le cellule non differenziate. Fare riferimento alla nota fornita al punto 1.4.15 per informazioni relative al terreno di coltura cellulare e alla matrice extracellulare.
- Aspirare il terreno e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione ai pozzetti e incubare per 5-7 minuti a 37 °C. Dissociare e singolarizzare le cellule pipettando delicatamente la soluzione del reagente di dissociazione sulle superfici dei pozzetti due o tre volte.
- Trasferire le cellule staccate in una provetta da 15 mL contenente 4 mL di terreno di mantenimento hiPSC e risospendere accuratamente le cellule. Riservare un'aliquota di 10 μl per la conta cellulare.
- Pellettare le cellule centrifugando per 5 minuti a 200 x g a 20-25 °C. Contare le cellule e calcolare il volume necessario per ottenere una densità appropriata di hiPSC (75-400 x 103 per pozzetto) in una piastra a 12 pozzetti rivestita con matrice a membrana basale (passaggio 1.1.1).
- Aspirare la soluzione di rivestimento dai pozzetti e aggiungere 1 mL di terreno hiPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK in ciascun pozzetto (diluizione 1:1.000). Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e dissociare il pellet in 1 mL di terreno hiPSC.
- Aggiungere il volume richiesto di hiPSC, determinato al punto 1.2.4, a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Da due a quattro piastre da 12 pozzetti possono essere sufficienti per differenziare un clone di hiPSC. Fare riferimento al passaggio 1.2.4 per determinare il numero di piastre necessarie per la semina delle cellule.
- Porre la piastra in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2). Distribuire uniformemente le cellule facendo scorrere delicatamente la piastra avanti e indietro e poi da un lato all'altro nell'incubatore.
- Il giorno successivo (cioè il giorno -2), scambiare il terreno con 2 mL di terreno di mantenimento hiPSC privo di inibitore ROCK. Il giorno successivo (giorno -1), sostituire il terreno con 2 mL di terreno di mantenimento hiPSC fresco.
- Induzione di EPC con l'inibitore della glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK-3) CHIR99021 (dal giorno 0 al giorno 5)
- Il giorno 0, sostituire il terreno di mantenimento hiPSC in ciascun pozzetto con 2 mL di terreno LaSR contenente 8 μM di CHIR99021.
- Il giorno 1, aspirare il terreno e aggiungere 2 ml di terreno LaSR fresco contenente 8 μM di CHIR99021.
- Nei giorni 2, 3 e 4, sostituire il terreno con 2 ml di terreno LaSR fresco privo di CHIR99021.
- Smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS) per purificare le EPC CD31+ (Giorno 5)
- Il giorno 5, aspirare il terreno e quindi aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione a ciascun pozzetto, prima di incubare per 6-8 minuti a 37 °C.
- Dissociare e singolarizzare le cellule con una micropipetta e farle passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per filtrare la sospensione in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di terreno DMEM/F12-10. Filtrare la sospensione cellulare raccolta da più di due piastre da 12 pozzetti in almeno due provette da 50 mL.
- Arrestare la reazione di digestione aggiungendo il terreno DMEM/F12-10 (fino a 50 mL). Pipettare accuratamente e riservare 10 μl per il conteggio delle cellule. Pellettare le celle mediante centrifugazione per 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
- Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 10 mL di terreno DMEM/F12-10 e trasferire la sospensione cellulare in provette fresche da 15 mL. Pellettare le celle mediante centrifugazione per 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
- Aspirare il surnatante e risospendere nel tampone di flusso-1 a una densità di 1,0 x 107 cellule per 100 μL di tampone.
- Aggiungere il reagente bloccante del recettore Fc (FcR) in un rapporto di 1:100 e incubare per 5 minuti prima di aggiungere l'anticorpo CD31 marcato con fluoresceina isotiocianato (FITC) diluito 1:200. Incubare la sospensione per 30 minuti al buio a 20-25 °C.
- Aggiungere 10 mL di tampone di flusso-1, riservando 10 μL di sospensione per l'analisi di citometria a flusso per determinare la frazione di cellule CD31+ (Figura 1).
- Pellettare le celle centrifugando a 200 x g per 5 min a 20-25 °C. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere a una densità di 1,0 x 107 cellule per 100 μL di soluzione tampone-1 di flusso. Aggiungere il cocktail di selezione FITC (5 μl per 100 μl di sospensione cellulare). Miscelare accuratamente pipettando e incubare al buio per 15 minuti a 20-25 °C.
- Aggiungere 5 μl di nanoparticelle magnetiche per 100 μl di sospensione cellulare, pipettare bene e incubare al buio per 10 minuti a 20-25 °C.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta per citometria a flusso da 5 mL e aggiungere il tampone di flusso-1 per ottenere un volume totale di 2,5 mL. Posizionare la provetta per citometria a flusso nel magnete per 5 minuti.
- Con un movimento continuo, capovolgere il magnete e decantare la sospensione cellulare contenente cellule che non sono state marcate con l'anticorpo FITC-CD31. Mantenere il magnete e il tubo in posizione capovolta per 2-3 s e quindi rimuovere il liquido rimanente. Aspirare eventuali goccioline sul bordo del tubo prima di riportare il tubo in posizione verticale.
- Prelevare la provetta per citometria a flusso dal magnete e aggiungere 2,5 mL di tampone di flusso-1 per lavare le cellule CD31+ rimanenti. Risospendere le cellule pipettandole delicatamente su e giù due o tre volte. Posizionare il tubo di flusso nel magnete per 5 minuti.
- Ripetere i passaggi 1.4.11-1.4.12 tre volte e poi il passaggio 1.4.11 ancora una volta per un totale di quattro lavaggi.
- Rimuovere il tubo di flusso dal magnete e aggiungere la quantità indicata di un terreno adatto (ad es. terreno privo di siero endoteliale umano [hECSR] per colture EC estese o terreno di congelamento per il congelamento) al tubo per risospendere le cellule CD31+ purificate. Riservare due aliquote da 10 μL della sospensione, una per il conteggio delle cellule e la seconda per eseguire l'analisi di citometria a flusso per valutare la purezza delle cellule CD31+ nei campioni post-MACS (Figura 1). Se un citometro a flusso non è immediatamente disponibile, conservare l'aliquota a 4 °C fino all'analisi.
- Congelare gli EPC CD31+ a questo punto.
nota: Le piastre a 12 pozzetti rivestite di vitronectina e il più stabile mezzo di manutenzione hiPSC (mTeSR plus) possono essere utilizzati al posto delle piastre rivestite con matrice a membrana basale e del mezzo di manutenzione hiPSC (mTeSR1). Per preparare piastre a 12 pozzetti rivestite di vitronectina, diluire la vitronectina con il tampone di diluizione a una concentrazione finale di 10 μg/mL e quindi trasferire 500 μl della soluzione diluita in ciascun pozzetto delle piastre a 12 pozzetti. Lasciare le piastre a 20-25 °C per almeno 1 ora. La densità di semina delle hiPSC singolarizzate è paragonabile a quella utilizzata per le piastre rivestite con matrice di membrana basale. La modifica del terreno di coltura o della composizione della matrice può influire sulla proliferazione e sulla differenziazione spontanea delle hiPSC, che in genere richiedono 1-2 settimane per adattarsi alle nuove condizioni di coltura. Se per la manutenzione dell'hiPSC viene utilizzato il mezzo di manutenzione hiPSC più stabile, questo mezzo può essere utilizzato per la differenziazione EPC al posto del mezzo di manutenzione hiPSC. In questo caso, il terreno di mantenimento hiPSC più stabile deve essere sostituito al giorno -2 per rimuovere l'inibitore ROCK e lo scambio al giorno -1 può essere saltato.
