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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione del terreno madre e recupero delle cellule staminali
- Preparare il terreno di coltura (DFHGPS) combinando i reagenti nei passaggi 1.1.1.-1.1.5.
- Aggiungere 210 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium ad alto contenuto di glucosio e L-glutammina (D). Conservarlo a 4 °C.
- Aggiungere 70 ml di miscela di nutrienti F12 di Ham's con l'integratore di L-glutammina (F). Conservarlo a 4 °C.
- Aggiungere 4,2 mL di tampone HEPES da 15 mM (H) e conservarlo a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4,2 mL di soluzione di D-glucosio al 10% (G) e conservarla a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2,88 ml di soluzione di penicillina/streptomicina (PS). Aliquotare la soluzione madre in aliquote da 3 mL e conservare le aliquote a -20 °C fino al momento del bisogno.
nota: La concentrazione finale di penicillina nel terreno sarà di 100 unità/mL e la concentrazione di streptomicina sarà di 100 μg/mL. Questo mezzo sarà indicato come DFHGPS per il resto del protocollo e deve essere conservato a 4 °C per l'uso entro 1-2 settimane. Se necessario, il DFHGPS può essere ingrandito proporzionalmente.
- Il giorno prima del recupero delle cellule, rivestire un pallone T75 con 5 mL di terreno condizionato ottenuto da precedenti colture della linea cellulare hNSC e lasciarlo in un incubatore a 37 °C con l'8,5% di anidride carbonica (CO2) per una notte.
nota: Se attualmente si coltivano hNSC, conservare il terreno in cui le cellule sono cresciute durante un cambio di terreno. Questo è un mezzo condizionato in quanto è stato "condizionato" dalle cellule. Il fluido condizionato può essere conservato in una provetta con tappo a vite e conservato a 4 °C per circa 7 giorni. Contatta l'autore corrispondente per ricevere le hNSC. Il terreno condizionato è preferibile ma non assolutamente necessario, in particolare quando si inizia la coltura di hNSC.
- Il giorno del recupero, scaldare 20 mL di DFHGPS in una provetta da 50 mL con tappo a vite in un bagnomaria a 37 °C per almeno 10 minuti e tenerlo a bagnomaria fino al momento dell'uso.
- In una provetta separata da 15 mL con tappo a vite, scaldare 10 mL di DFHGPS in un bagnomaria a 37 °C per almeno 10 minuti e tenerlo a bagnomaria fino al momento dell'uso al punto 1.13.
- Recupera un contenitore di ghiaccio e tutti i componenti del mezzo (Tabella 1). Scongelare tutti i componenti medi sul ghiaccio e lasciarli sul ghiaccio mentre ci si prepara per il cambio medio.
- Procurare 5 mL di brodo di terreno condizionato (conservato a 4 °C) e conservarlo a bagnomaria a 37 °C fino al momento dell'uso al punto 1.14. Vedere la nota dopo il passaggio 1.2 se non esiste un mezzo condizionato o una coltura di cellule staminali neurali neurali umane umane in corrente.
- Recuperare la provetta con tappo a vite da 50 ml del passaggio 1.3 e posizionarla nella camera di biosicurezza (BSC). Trasferire 10 mL di DFHGPS in una nuova provetta da 15 mL con tappo a vite, quindi rimettere la provetta da 50 mL contenente i restanti 10 mL di terreno DFHGPS nel bagnomaria a 37 °C.
- Procurarsi una crio-fiala di hNSC conservate in azoto liquido. Vedere la nota dopo il passaggio 1.2 se non esiste attualmente una coltura di cellule staminali neurali neurali fetali umane.
nota: Le cellule staminali neurali umane sono state originariamente derivate da cervelli fetali umani scartati12 e mantenute in coltura senza modificazioni genetiche10. 5 × 106 celle devono essere scongelate e piastrate su un matraccio T75. Ogni crio-fiala deve contenere 5 × 106 cellule; pertanto, è necessario un flaconcino per pallone.
- Scongelare un flaconcino di cellule in un bagno d'acqua a 37 °C capovolgendo il flaconcino ogni 10 s per circa 1 minuto o fino a quando il ghiaccio non si è sciolto e il contenuto del flaconcino è completamente liquido. Non immergere l'intera fiala sotto l'acqua per evitare potenziali contaminazioni.
- Nella BSC, utilizzare una micropipetta P1000 per aspirare la soluzione cellulare scongelata e aggiungerla goccia a goccia alla provetta da 15 mL del passaggio 1.7, contenente 10 mL di DFHGPS. Per aggiungere la soluzione cellulare scongelata goccia a goccia, premere lentamente sullo stantuffo in modo che vengano rilasciate solo una o due gocce alla volta. Nel frattempo, agitare la provetta da 15 ml per consentire una miscelazione rapida.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante, assicurandosi di trattenere il pellet della cella.
- Durante il passaggio 1.11, recuperare la provetta da 50 mL contenente i restanti 10 mL del passaggio 1.7. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare nel DFHGPS da 10 mL e centrifugare nuovamente a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Durante la centrifuga finale, preparare il nuovo terreno di coltura seguendo la Tabella 1 per aggiungere fattori di crescita ai 10 ml di terreno DFHGPS dal passaggio 1.4 (Tabella 1) in BSC. Lasciare il nuovo terreno contenente fattori di crescita nella BSC fino al momento dell'uso.
- Recuperare il pallone T75 dal punto 1.2 ed eliminare il mezzo condizionato che ricopre il pallone mediante aspirazione. Quindi, aggiungere i 5 mL di terreno condizionato del passaggio 1.6. al matraccio utilizzando una pipetta sierologica. Fare attenzione a non graffiare il fondo del pallone.
- Recuperare la provetta di cellule dalla centrifuga e scartare il surnatante aspirandolo, lasciando intatto il pellet cellulare.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di nuovo terreno dal passaggio 1.13 utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL e pipettando su e giù più volte. Aggiungere la sospensione al pallone T75 rivestito dal passaggio 1.14. Utilizzare i restanti 5 mL per sciacquare la provetta che conteneva il pellet di cellule, quindi aggiungere anche quei 5 mL al pallone.
- Far oscillare il pallone T75 avanti e indietro 3 volte per assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente sul pallone. Assicurarsi che il tappo del pallone sia allentato per consentire il flusso d'aria. Al microscopio ottico, osserva le cellule, prendi appunti e scatta immagini, se possibile.
nota: Le cellule dovrebbero apparire traslucide e sferiche. Prendi nota se ci sono celle che sembrano scure, opache o hanno bordi asimmetrici, poiché ciò può indicare la morte cellulare. Inoltre, fai attenzione a qualsiasi contaminazione fungina o batterica, come il terreno che diventa di colore giallo.
- Porre il matraccio di cellule in un incubatore a 37 °C con CO2,< / >
nota: Utilizzare l'8,5% invece del 5,0% di CO2 per mantenere il pH di questo terreno di coltura privo di siero nell'intervallo 7,1-7,4.
2. hNSC Cambio medio
NOTA: Cambia il mezzo ogni 3-4 giorni.
- Accendi il BSC e pulisci accuratamente con etanolo al 70%. Osservare le cellule al microscopio ottico.
nota: Prendi nota dell'aspetto delle celle e delle dimensioni delle sfere. Tre giorni dopo il recupero o il passaggio, le cellule si raggruppano e iniziano a formare neurosfere non aderenti><.
cautela: Se le cellule aderiscono al fondo del pallone, la coltura dovrà essere scartata poiché l'adesione cellulare aumenterà la differenziazione prematura e le cellule non saranno in grado di mantenere uno stato staminale. Se ci sono troppe cellule nel pallone, le cellule possono formare grandi sfere (maggiori di 2 mm di diametro), nel qual caso le cellule al centro della sfera inizieranno a differenziarsi a causa della mancanza di accesso ai fattori di crescita nel mezzo. Se si osservano sfere di diametro superiore a 1 mm, le celle possono essere fatte passare (passaggi 3.1-3.22).
- Seguire i passaggi 1.4 e 1.5 e preparare 10 ml di terreno fresco (vedere il passaggio 1.13).
- Inclinare il pallone di lato, lasciando che le sfere affondino sul fondo del pallone.
- Rimuovere 5 mL di terreno condizionato dalla parte superiore del terreno raccolto utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, facendo attenzione a non aspirare alcuna neurosfera. Inserire i 5 mL di terreno condizionato in una provetta pulita da 15 mL.
- Rimuovere altri 5 mL di terreno condizionato dal pallone, evitando nuovamente accuratamente le sfere, e inserire i 5 mL nella stessa provetta da 15 mL.
- Aggiungere 10 mL di terreno nuovo dal passaggio 2.2 ai restanti 5 mL di terreno condizionato e cellule nel pallone. Appoggiare il pallone in piano e osservare le cellule al microscopio ottico.
- Se risulta che le cellule sono state aspirate durante la raccolta del terreno condizionato, centrifugare il terreno condizionato a 100 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule che si accumulano sul fondo in 1 mL del terreno condizionato, quindi aggiungerle al pallone di coltura.
- Conservare i 10 mL di terreno condizionato non utilizzato dai passaggi 2,5/2,6 a 4 °C in una provetta da 15 mL con tappo a vite.
- Ripetere i passaggi 1.17/1.18.
3. Passaggio hNSC
- Se si espandono le NSC in un nuovo pallone, assicurarsi che tutti i nuovi palloni siano rivestiti come al punto 1.2.
- Pulire il BSC come al punto 2.1 ed eseguire i passaggi 1.4 e 1.5.
- Preparare il terreno come al punto 1.13. Ogni matraccio T75 richiede 10 ml di terreno. Per più matracci T75, moltiplicare 10 mL di terreno per il numero di flaconi.
- Preparare 1 o 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (dPBS) e glucosio di Dulbecco e metterli in un bagnomaria a 37 °C per riscaldare per 10 minuti (per la soluzione di tripsina) secondo i volumi nella Tabella 2. Non aggiungere tripsina o DNasi in questo momento. La DNasi può essere necessaria per abbattere qualsiasi DNA rilasciato dalle cellule morte a causa della dissociazione meccanica o chimica delle cellule><.
NOTA: Per un pallone T75 passato dopo 9-10 giorni di crescita, ci saranno circa 30 × 106 celle se 5 × 106 sono state originariamente seminate sul pallone. Tipicamente, 1 mL di soluzione dPBS viene utilizzato per 10 × 106 cellule. Pertanto, sono necessari 3 mL di soluzione di dPBS per un matraccio T75 passato dopo 9-10 giorni.
- Posizionare una piccola pesa e un emocitometro puliti nella cappa. Pulire con etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria nella cappa per circa 5 min.
nota: La pesa verrà utilizzata nei passaggi 3.17.1.
- Recuperare il pallone di cellule che verrà fatto passare dall'incubatrice e portarlo nel BSC. Inclinare delicatamente il pallone in modo che le cellule affondino sul fondo del terreno accumulato. Ci sono circa 15 mL di terreno nel pallone.
- Rimuovere circa 10 mL di terreno in porzioni da 5 mL (cioè 5 mL + 5 mL). Inserire questi 10 ml di terreno in una provetta da 15 ml pulita etichettata "CM" per "terreno condizionato". Fare attenzione a non aspirare nessuna delle cellule depositate nei restanti 5 mL di terreno nel pallone; queste cellule e 5 mL di terreno saranno sottoposti alla fase 3.8.
- Prelevare 3 mL di terreno condizionato dalla provetta "CM" (dal passaggio 3.7) e inserirli in una provetta da 15 mL etichettata come "soluzione inibitrice della tripsina". Questo verrà utilizzato nel passaggio 3.12. Dopo la rimozione dei 3 mL, rimangono 7 mL di terreno condizionato nella provetta "CM". Mettere da parte il tubo "CM" fino al passaggio 3.9.
- Rimuovere i 5 mL di terreno e le cellule rimanenti nel pallone T75 e metterli in una provetta da 15 mL pulita con l'etichetta "Cells".
- Prelevare la provetta "CM" contenente 7 mL di terreno condizionato (dal punto 3.7.1) e sciacquare due volte il fondo del pallone T75 con 3,5 mL di porzione di terreno condizionato utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL. Dopo ogni risciacquo, inserire le porzioni da 3,5 ml nella provetta "Cells". Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere tutte le neurosfere (cellule) dal pallone T75.
- Centrifugare la provetta "Cells" a 100 x g per 5 min a temperatura ambiente. Mentre le cellule girano, ottenere una soluzione di dPBS/glucosio da un bagno d'acqua a 37 °C e aggiungere la quantità appropriata di tripsina e DNasi secondo la Tabella 2.
- Dopo che la provetta "Cells" ha smesso di girare, rimuovere tutto il surnatante condizionato e trasferirlo nella provetta "CM".
- Prelevare la provetta con la dicitura "soluzione inibitrice della tripsina" del punto 3.7.1 e aggiungere il volume di inibitore della tripsina indicato nella Tabella 3. Utilizzare lo stesso volume di soluzione di inibitore della tripsina utilizzato per la soluzione di tripsina.
- Mettere la soluzione di inibitore della tripsina nel bagnomaria a 37 °C fino al momento del bisogno.
- Aggiungere la soluzione di tripsina al pellet cellulare nella provetta da 15 ml e pipettare su e giù circa 5-10 volte con una pipetta da 5 ml. Chiudere il tappo della provetta e incubare a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti. Dopo 5 minuti, recuperare le cellule e pipettare su e giù 5-10 volte. Quindi, incubare in bagnomaria a 37 °C per altri 10-15 minuti.
- Negli ultimi 5 minuti, spostare la soluzione di inibitore della tripsina nella BSC.
- Recuperare le cellule al termine del passaggio 2.14 e pipettare le cellule su e giù fino a quando le sfere non sono completamente dissociate (20-30 volte). Quindi, aggiungere immediatamente la soluzione di inibitore della tripsina e pipettare su e giù 10 volte. Questa soluzione di cellule dissociate e inibitore della tripsina sarà indicata come "sospensione cellulare".
- Contare il numero di cellule nella sospensione cellulare seguendo i passaggi.
- Pipettare 15 μl di premiscela di Trypan Blue (contenente 5 μl di blu di tripano allo 0,4% e 10 μl di dPBS) su una piccola pesa, quindi aggiungere 5 μl di sospensione cellulare. Pipettare su e giù 3-5 volte per mescolare. Quindi, pipettare 10 μl della sospensione di Trypan Blue/cell su entrambi i lati di un emocitometro coperto da un vetrino coprioggetti.
- Osserva le cellule al microscopio ottico e conta il numero totale di cellule in ciascuna delle quattro griglie angolari. Somma questi numeri.
- Ripeti il conteggio per l'altro lato e fai la media dei due lati.
- Moltiplica questo numero per 10.000 per ottenere il numero totale di cellule per ml. Moltiplica questo numero per il numero totale di millilitri per calcolare il numero totale di cellule nella sospensione cellulare. Calcola quanto volume di sospensione cellulare sarà necessario per seminare 5 milioni di cellule per matraccio T75.
nota: In genere, dopo 9-10 giorni, un T75 avrà 25-30 × 106 cellule. Pertanto, se si passano tutte le cellule in nuovi flaconi, sono necessari un totale di 5-6 fiasche.
- Aggiungere il volume di sospensione cellulare calcolato al punto 3.19 a ciascun matraccio T75 per ottenere 5 × 106 celle per pallone. Se il volume è inferiore a 5 mL, aggiungere ulteriore terreno di coltura per ottenere un totale di 5 mL. Quindi aggiungere al matraccio 10 mL di nuovo terreno DFHGFPS contenente fattori di crescita (Tabella 1).
- Ripetere i passaggi 1.17 e 1.18 e assicurarsi che il pallone sia etichettato con il tipo di celle, le date, il numero di celle nel pallone e il numero di passaggio (questo è il numero di volte in cui la cella è stata fatta passare). Quindi, vai al passaggio 4.
- Se necessario, seminare altre cellule in un pallone T75 con una densità fino a 30 × 106 celle per pallone durante la notte e congelare il giorno successivo secondo la fase 4.
4. Congelamento e conservazione hNSC
- Il giorno dopo il passaggio, recuperare il pallone dall'incubatrice contenente le celle per il congelamento (dai passaggi 3.19 e 3.22). Inclinare il matraccio e rimuovere tutto il terreno e le cellule dal pallone, quindi metterlo in una provetta da 15 ml. Quindi, centrifugare la provetta a 216 x g per 5 minuti.
- Durante il processo di centrifugazione, preparare il mezzo di congelamento (Tabella 4). Per ogni 5 × 106 cellule, preparare 1 ml di terreno di congelamento. Il numero di cellule è stato determinato al punto 3.19 per determinare il numero di cellule da inserire in ciascun pallone. Questo numero non sarà cambiato da un giorno all'altro.
- Preparare fiale di crioconservazione con etichette con il nome della cella, il numero di passaggio, il numero della cella, le iniziali e la data. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante mediante aspirazione e risospendere il pellet di cella nel mezzo di congelamento in modo che vi siano 5 × 106 cellule/mL. Utilizzando una pipetta da 5 mL, aliquotare 1 mL per flaconcino e chiudere ermeticamente (5 × 106 cellule per flaconcino).
- Mettere le fiale in un contenitore crioconservabile con 250 ml di isopropanolo (l'utilizzo massimo è di 5 volte per sostituzione di isopropanolo). Conservare in un congelatore a -80 °C per una notte, quindi trasferire in un sistema di stoccaggio con serbatoio di azoto liquido.
5. Placcatura di hNSC aderenti per la convalida
- Il giorno prima del passaggio (passaggi 3.1-3.22), pulire il BSC come al punto 2.2 e procurarsi una piastra a 24 pozzetti e vetrini sterili da 12 mm.
- Usando una pinza, posizionare un singolo vetrino coprioggetti sul fondo di ciascun pozzetto della piastra.
- Rivestire i pozzetti contenenti vetrini coprioggetti con poli-D-lisina (PDL) allo 0,01% in acqua sterile e incubare per 1 ora a 37 °C. Per una piastra a 24 pozzetti, utilizzare 250 μl di PDL per pozzetto.
- Rimuovere il PDL dai pozzetti, quindi rivestirlo con 1 μg/cm2 di laminina/dPBS (250 μl per pozzetto). Incubare la piastra per una notte a 37 °C. Se non è necessario il giorno successivo, sigillare la lastra con parafilm avvolgendo il parafilm attorno ai bordi della lastra e conservare a 4 °C.
nota: Le piastre rivestite con laminina possono essere conservate fino a 2 settimane se sigillate con parafilm, purché i vetrini coprioggetti non si asciughino.
- Far passare le celle come descritto nei passaggi 3.1-3.22, quindi determinare il numero di cellule da seminare nella piastra a 24 pozzetti con vetrini coprioggetti rivestiti.
- Rimuovere la soluzione di laminina in eccesso dai pozzetti attraverso l'aspirazione e risciacquare una volta con 0,5 ml di dPBS. Quindi, seminare le cellule nei pozzetti a una densità di 0,6-1 x 105 cellule/cm2 per pozzetto. Utilizzare le celle rimanenti secondo i passaggi 3.16-3.21.
- In vari momenti durante la coltura su piastra a 24 pozzetti, fissare e colorare le cellule per vari marcatori di cellule staminali.