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1. Generazione di aggregati iPSC
- Generazione di colture monostrato a cellula singola da colonie di iPSC
- Preparare una piastra a 6 pozzetti rivestita di estratto di membrana basale (BME). Scongelare il BME sul ghiaccio a 4 °C per 2-3 ore, diluirlo con il Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12; diluizione 1:50), coprire la piastra con 1 mL/pozzetto della soluzione diluita di BME e conservare la piastra per una notte a 4 °C.
- Aspirare il terreno e lavare due volte le colonie di iPSC intatte di almeno due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con EDTA 0,5 mM in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) prima di incubare le colonie con acido etilendiamminotetraacetico 0,5 mM (EDTA) in PBS per 4 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare la soluzione di EDTA e staccare delicatamente le colonie lavandole via dal fondo del piatto con 5 mL di terreno DMEM-F12. Raccoglierli in una provetta da 15 ml e pellettarli mediante centrifugazione (4 min a 1.200 x g a RT).
NOTA: Le iPSC riprogrammate da fibroblasti disponibili in commercio sono state utilizzate con successo.
- Aspirare il surnatante e incubare le colonie di iPSC con 500 μL di reagente di dissociazione cellulare per 6 minuti a 37 °C.
- Pipetettare la sospensione cellulare più volte delicatamente su e giù con una pipetta da 1 mL per rompere i restanti gruppi di cellule in singole cellule.
- Aggiungere 4 mL di DMEM-F12 alla sospensione cellulare per diluire il reagente di dissociazione cellulare.
- Centrifugare le celle a 1.200 x g per 4 minuti a RT.
- Risospendere le cellule in 2 mL di terreno iPSC integrato con 5 μM di Y-27632 e seminare le cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita di BME.
nota: Utilizzare il terreno iPSC specificato nella Tabella dei materiali per colture iPSC monostrato a cellula singola.
- Il giorno successivo, sostituire il mezzo con un nuovo mezzo iPSC privo di Y-27632. Da questo punto, continuare a coltivare le cellule, cambiando il terreno ogni giorno fino a quando le iPSC non sono confluenti al 100%. A seconda della linea cellulare e della confluenza dei pozzetti di partenza, questo richiederà dai 2 ai 4 giorni.
- Una volta confluenti, passano le iPSC. Aspirare il terreno e applicare 500 μl di reagente di dissociazione cellulare sulle cellule.
- Incubare le cellule per 5-10 minuti a 37 °C. Scuotere delicatamente la piastra per staccare le cellule.
- Lavare le cellule dal pozzetto utilizzando 2 mL di DMEM-F12 e raccoglierle in una provetta da 15 mL. Aggiungere DMEM-F12 per un volume totale di 5 mL.
- Far girare le cellule a 1.200 x g per 4 minuti a RT e aspirare il surnatante.
- Seminare le cellule in terreno iPSC integrato con 5 μM di Y-27632 in un rapporto da 1:2 a 1:4 su una piastra a 6 pozzetti rivestita di BME (2 mL/pozzetto di terreno).
- Continuare a coltivare le cellule per 2-5 giorni e cambiare il terreno iPSC privo di Y-27632 ogni giorno. Una volta confluente, passaggio iPSC (passaggi 1.1.4-1.1.8).
nota: Coltivare le iPSC per almeno 2 passaggi come monostrato nel terreno iPSC specificato nella tabella dei materiali prima di utilizzarle per la generazione di aggregati iPSC per consentire alle cellule di adattarsi alle condizioni di coltura.
- Utilizzare colture iPSC monostrato quando sono confluenti al 70-90% per la generazione di aggregati iPSC.
NOTA: le iPSC si sono adattate alle condizioni di coltura in quanto le singole cellule sono meno inclini allo stress che porta alla morte cellulare durante la procedura di dissociazione e aggregazione. Le colture di iPSC monostrato devono mostrare una tipica morfologia pluripotente senza evidenza di differenziazione. Testare regolarmente le colture per verificare la presenza di contaminazione da micoplasma. Funziona solo con colture di iPSC prive di micoplasmi.
- Aspirare il terreno di coltura da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e applicare 500 μl di reagente di dissociazione cellulare sulle cellule.
- Incubare le cellule per 5-10 minuti a 37 °C. Scuotere delicatamente la piastra per staccare le cellule.
- Lavare le cellule dal pozzetto utilizzando 2 mL di DMEM-F12 e raccoglierle in una provetta da 15 mL. Aggiungere DMEM-F12 per un volume totale di 10 mL.
- Per la conta cellulare, prelevare 25 μl dalla sospensione cellulare e mescolarli con 25 μl di blu di tripano per marcare le cellule morte. Contare le cellule viventi utilizzando una camera di conteggio.
- Raccogliere un numero sufficiente di cellule (4.500 cellule per aggregato iPSC) dalla sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
- Far girare le cellule a 1.200 x g per 4 minuti a RT e aspirare il surnatante.
- Risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno iPSC integrato con 50 μM di Y-27632 per ottenere 4.500 cellule vive per 150 μL.
nota: L'uso di un'alta concentrazione di Y-27632 (50 μM) è fondamentale per la sopravvivenza delle iPSC.
- Piastra 150 μl in ciascun pozzetto di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti a basso attacco e posizionarla nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2,
nota: Quando si generano aggregati iPSC, considerare che sono necessari almeno 6 organoidi per il controllo di qualità al giorno 20 (vedere la Sezione 5).
2. Induzione del neuroectoderma anteriore
- Monitora attentamente i cambiamenti morfologici degli aggregati iPSC ogni giorno al microscopio per colture tissutali utilizzando una lente di potenza 4X o 10X. Osserva al giorno 1, aggregati cellulari con bordi chiari. Continuare a coltivare aggregati iPSC nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2,
nota: Un certo numero di cellule morte/pozzetto è normale e non influenzerà la generazione di organoidi.
- Alimentare gli aggregati iPSC a partire dal giorno 2 e continuando a giorni alterni aspirando delicatamente circa 2/3 del terreno senza disturbare gli aggregati cellulari sul fondo. Aggiungere altri 100 μl di terreno iPSC privo di Y-27632.
nota: Entro 4-6 giorni gli aggregati cellulari avranno un diametro di 350-450 μm e mostreranno bordi lisci.
- A questo punto, raggruppare gli aggregati cellulari con un puntale di pipetta da 100 μL in un piatto di 6 cm a basso attacco (massimo 20 aggregati/piatto) in un terreno di induzione corticale contenente DMEM-F12 con integratore di N2 (1:200), integratore di B27 (1:100), glucosio (0,2 mg/mL), adenosina monofosfato ciclico (cAMP; 0,15 μg/mL), 0,5% di aminoacidi non essenziali (NEAA), 1% L-alanil-L-glutammina, eparina (10 μg/mL) e i composti LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) e inibitore della risposta Wnt-1 (IWR-1) (10 μg/mL). Nutrire gli aggregati cellulari cambiando il mezzo di induzione corticale 3 giorni dopo averli trasferiti nel piatto da 6 cm.
- Monitorare attentamente i cambiamenti morfologici durante l'induzione corticale al microscopio per colture tissutali utilizzando una lente di potenza 4X.
nota: Dopo 4-5 giorni nel mezzo di induzione corticale, i bordi degli aggregati cellulari dovrebbero iniziare a schiarirsi in superficie, indicando la differenziazione neuroectodermica. In questa fase, emerge l'organizzazione radiale di un epitelio pseudostratificato. Procedere alla Sezione 3 per incorporare gli aggregati cellulari in una matrice BME.
3. Incorporazione di aggregati neuroectodermici in un'impalcatura di matrice
- Scongelare il BME con ghiaccio a 4 °C per 2-3 ore. Aliquotare il BME non diluito in quantità sufficiente.
- Preparare un foglio di pellicola di paraffina di plastica per la procedura di inclusione. Tagliare il film di paraffina di plastica usando le forbici sterili in pezzi grandi 4 cm x 4 cm, mettere un pezzo di film di paraffina di plastica su un vassoio vuoto da 100 μL per puntali da 100 μL e premere con un dito guantato in modo da creare piccole fossette nel foglio di pellicola di paraffina di plastica (è necessaria 1 fossetta/aggregato cellulare). Pulire il film di plastica di paraffina con etanolo al 70% e irradiarlo con luce UV (potenza: 15 watt, lunghezza d'onda: 435 nm) sotto il banco sterile chiuso per 30 minuti.
- Trasferire ogni aggregato cellulare in una fossetta del foglio di pellicola di paraffina di plastica utilizzando una punta tagliata da 100 μl con un'apertura di 1,5-2 mm di diametro. Nel caso in cui due aggregati cellulari siano fusi, non separarli ma trasferirli insieme in una fossetta.
- Aspirare delicatamente il terreno che circonda gli aggregati cellulari utilizzando un puntale per pipetta da 100 μl non tagliato.
nota: Fare attenzione a non aspirare gli aggregati cellulari nella punta, poiché ciò danneggerebbe gli aggregati.
- Aggiungere 40 μl di BME non diluito a ciascun aggregato cellulare.
- Posizionare ciascun aggregato di cellule al centro della goccia BME utilizzando un puntale per pipetta da 100 μL non tagliato.
nota: Fare molta attenzione a non danneggiare il neuroepitelio in via di sviluppo con la punta della pipetta.
- Trasferire con cura il foglio di pellicola di paraffina di plastica utilizzando una pinza sterile in una piastra di Petri da 10 cm (o un'altra piastra di coltura cellulare sufficiente) e posizionare la piastra nell'incubatore per 15-20 minuti per consentire al BME di solidificarsi.
- Nel frattempo, preparare un piatto da 6 cm a basso attacco contenente 5 ml di terreno di induzione corticale.
- Dopo la polimerizzazione del BME, rimuovere le goccioline contenenti gli aggregati cellulari dal foglio di film plastico di paraffina. Utilizzando una pinza sterile, capovolgere la pellicola di paraffina di plastica e spremere delicatamente gli aggregati cellulari nel piatto di 6 cm a basso attacco leggermente inclinato (circa 30 °) fino a quando le goccioline cadono dal foglio di pellicola di paraffina di plastica. Trasferire un massimo di 16 aggregati di celle in un piatto di 6 cm.
- Continuare a incubare gli aggregati cellulari a 37 °C.
4. Generazione di organoidi di tipo proencefalico da aggregati neuroectodermici
- Un giorno dopo l'inclusione in una matrice BME, posizionare le piastre di coltura degli organoidi su un agitatore per colture cellulari a dondolo con un angolo di inclinazione di 5° e 14 giri/min, installato in un incubatore per colture cellulari.
- Monitora gli organoidi ogni giorno. Strutture omogenee simili a loop neuroepiteliali si sviluppano gradualmente dopo l'incorporamento nella matrice BME.
- Quando le strutture dell'ansa neuroepiteliale sono visibili, cambiare il terreno in terreno di differenziazione degli organoidi contenente DMEM-F12 con integratore di N2 (1:200), integratore di B27 (1:100), glucosio (0,2 mg/mL), cAMP (0,15 μg/mL), 0,5% NEAA, 1% L-alanil-L-glutammina, insulina (2,5 μg/mL)
- Sostituire il mezzo di differenziazione dell'organoide ogni 3-4 giorni fino a raggiungere il punto temporale di differenziazione desiderato. Quindi, fissare gli organoidi (vedi Sezione 5).
nota: Occasionalmente, il tessuto può mostrare gemme di tessuto otticamente traslucido senza strutture ad anello. Sebbene questo non sia l'ideale, ciò non influisce sullo sviluppo delle strutture corticali. Gli organoidi possono essere coltivati in terreno di differenziazione per un massimo di 40 giorni. Per periodi di coltura prolungati (40-100 giorni) il terreno di differenziazione degli organoidi può essere integrato con BME 1:50 per aumentare la complessità tissutale e con BDNF e GDNF per consentire la sopravvivenza e la maturazione neuronale.