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1. Preparazione dei materiali necessari per la coltura iPSC e la differenziazione BEC.
- Rivestimento della matrice di plastica per colture tissutali (TC) per colture iPSC IMR90-4
- Aliquotare il gel della matrice della membrana basale (ad es. Matrigel) in aliquote da 2,5 mg e conservare a -20 °C.
nota: Lavorare rapidamente quando si maneggia il gel matrice e l'aliquota con ghiaccio, poiché forma un gel a una temperatura superiore a 4 °C e non può essere aliquotato una volta solidificato.
- Per il rivestimento della plastica TC, aggiungere rapidamente un'aliquota di gel matrice a 30 ml di terreno Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 di Dulbecco in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere 1 mL di terreno sul gel della matrice congelata, pipettare su e giù fino a scongelarlo e trasferirlo immediatamente nella provetta conica da 50 mL con il terreno rimanente.
- Utilizzare 1 mL di questa soluzione di rivestimento in gel per matrice per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 12 mL per pallone T75.
nota: La plastica TC rivestita di gel Matrix può essere preparata fino a due settimane prima dell'uso. Tuttavia, è fondamentale evitare che la soluzione di gel della matrice si asciughi, il che potrebbe richiedere l'aggiunta occasionale di più DMEM/F12 sopra i pozzetti.
- Preparare il terreno di mantenimento delle cellule staminali aggiungendo 50 mL di integratore 50x a 450 mL di terreno basale di mantenimento delle cellule staminali nell'ambiente sterile di una cappa di biosicurezza.
- Per preparare 500 mL di terreno incondizionato (UM), combinare 392,5 mL di DMEM/F12 con 100 mL di siero sostitutivo knock out (KOSR), 5 mL di aminoacidi non essenziali, L-glutammina a una concentrazione finale di 1 mM e 3,5 μL di β-mercaptoetanolo. Filtrare-sterilizzare e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Per preparare 200 mL di terreno a cellule endoteliali (EC) più acido retinoico (RA) più bFGF, combinare 198 mL di terreno libero da siero endoteliale umano (hESFM), 2 mL di siero derivato povero di piastrine (PDS) sterilizzato con filtro e 20 ng/mL di bFGF. Filtrare, sterilizzare e conservare fino a 2 settimane a 4 °C. Poco prima dell'aggiunta alle cellule, aggiungere 10 μM di AR al terreno EC.
nota: Poiché la PDS è stata interrotta e può quindi essere limitata, questo protocollo è stato condotto con successo utilizzando la B27 al posto della PDS.
- Per preparare 200 mL di terreno EC senza AR o bFGF, combinare 198 mL di hESFM e 2 mL di PDS sterilizzato con filtro e sterilizzare con filtro. Conservare fino a 4 settimane a 4 °C.
2. Differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali dalle iPSC umane
- Placcatura di iPSC per il differenziamento (giorno -3 del protocollo di differenziazione)
- Secondo la coltura di mantenimento IMR90-4 ben utilizzata per la piastra per la differenziazione, aspirare il terreno di coltura, aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare enzimatica per pozzetto e incubare a 37 °C per 7 minuti.
- Inattivare il reagente di dissociazione cellulare enzimatica trasferendo 1 mL di sospensione cellulare dissociata in una provetta conica da 15 mL con almeno 2 mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali fresche per 1 mL di cellule. Far girare la sospensione cellulare a 1.500 x g per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali per pozzetto di cellule IMR90-4 utilizzate e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
nota: Può essere utile diluire 1:1 con blu di tripano allo 0,4% per distinguere tra cellule vive e morte durante il conteggio. A seconda della densità delle iPSC, un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti di solito produce 1\u20122 x 106 cellule.
- Per la differenziazione in un matraccio T75, aggiungere 7,5 x 105 cellule a 12 mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali e inibitore ROCK (Y27632 dicloridrato) a una concentrazione finale di 10 μM. Aspirare la soluzione di rivestimento in gel della matrice da un pallone T75 e trasferire la sospensione cellulare nel pallone. Distribuire equamente le celle agitando il matraccio avanti e indietro e da sinistra a destra e incubare a 37 °C e 5% di CO2,
nota: È fondamentale aggiungere l'inibitore ROCK in questa fase per migliorare la sopravvivenza delle singole cellule staminali dissociate. Le cellule devono essere distribuite uniformemente nel pallone e nei singoletti che presentano una morfologia mesenchimale diffusa a causa del trattamento con inibitore ROCK.
- Il giorno -2 e il giorno -1, sostituire il terreno con un terreno di mantenimento con cellule staminali fresche; 12 mL per T75.
- Il giorno 0, iniziare la differenziazione cambiando il terreno in UM; 12 mL per T75.
- Cambia UM ogni giorno (giorno 1 - giorno 5).
nota: Le cellule in genere raggiungono la confluenza dopo 2 o 3 giorni in UM, che può essere osservata ad occhio nudo o attraverso un microscopio a campo chiaro invertito. Man mano che la differenziazione progredisce, i "tratti neurali" nestina+ diventano visibili con le cellule PECAM-1+ in mezzo.
- Espandere selettivamente la popolazione di cellule endoteliali passando al terreno EC con 20 ng/mL di bFGF e 10 μM di acido retinoico (RA) (giorno 6) e incubando per due giorni. Il terreno EC con bFGF può essere preparato fino a due settimane prima. L'artrite reumatoide viene aggiunta dal materiale congelato il giorno dell'uso (ad esempio, 1 μl di 10 mM di brodo di AR per 1 mL di EC + bFGF).
nota: Una differenziazione di successo può essere ottenuta anche senza l'integrazione di AR ai giorni 6 e 8. L'omissione di AR, tuttavia, produrrà BEC con TEER ridotto.
- Rivestire le piastre di coltura cellulare e gli inserti di membrana (ad es. Transwell) con collagene IV e fibronectina (giorno 7), per la purificazione dei BEC e gli esperimenti successivi.
- Per il rivestimento degli inserti della membrana, combinare 4 parti di collagene IV (1 mg/mL in 0,5 mg/mL di acido acetico), 1 parte di fibronectina (1 mg/mL) e 5 parti di acqua sterile per tessuti. La soluzione ECM può essere diluita 1:5 per il rivestimento di piastre di coltura cellulare (ad esempio, 4 parti di collagene IV, 1 parte di fibronectina, 45 parti di acqua). Incubare con la soluzione di rivestimento a 37 °C durante la notte.
NOTA: Le piastre e gli inserti a membrana possono anche essere rivestiti per almeno 4 ore prima della subcoltura lo stesso giorno della fase di purificazione.
- Purificare le BEC subcolturando le cellule differenziate su piastre rivestite di collagene IV e fibronectina o inserti di membrana (giorno 8).
- Aspirare il terreno EC e aggiungere il reagente di dissociazione cellulare enzimatica (12 mL per T75). Incubare a 37 °C fino a quando il 90% delle cellule si è staccato dal pallone.
nota: La dissociazione cellulare può richiedere fino a 1 ora.
- Durante il tempo di incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento di collagene IV/fibronectina dalle piastre/inserti precedentemente preparati e lasciarli asciugare in una cappa sterile. Ci vogliono circa 20 minuti perché gli inserti si asciughino.
- Una volta che le cellule si sono staccate, lavarle via dal matraccio con una pipetta da 10 ml. Pipettare su e giù per ottenere una sospensione a cella singola.
nota: La sospensione di una singola cellula è importante per un conteggio affidabile delle cellule e per ottenere monostrati solidi.
- Diluire con almeno lo stesso volume di hESFM fresco in una provetta conica da 50 mL e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Pellettare le celle a 1.500 x g per 10 min.
- Risospendere le cellule in un volume appropriato di EC + bFGF + RA appena preparato per ottenere una sospensione di 2 x 106 cellule/mL per la semina su inserti di membrana. Aggiungere 500 μl (1 x 106 cellule) sopra un inserto a 12 pozzetti e 1,5 mL di terreno EC + bFGF + RA sul fondo. Per la semina su piastre da 24 e 48 pozzetti, diluire la sospensione cellulare 1:2 e aggiungere rispettivamente 500 μl (5 x 105 cellule) e 250 μl (2,5 x 105 cellule) per pozzetto. Distribuire uniformemente le cellule sul pozzetto/inserire e incubare a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Cambiare il fluido su piastre/pozzetti in EC senza bFGF o RA (giorno 9).