Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Isolamento della frazione vascolare stromale (SVF)
Raccogli il tessuto adiposo dell'arco periaortico (PAAT) di 5-6 topi in una provetta da microcentrifuga da 2 ml contenente 1 ml di terreno di digestione appena preparato e trita il tessuto usando le forbici chirurgiche in una provetta Eppendorf a temperatura ambiente (RT).
- Trasferire la miscela in provette da 50 mL contenenti 9 mL di terreno di digestione. Omogeneizzare i tessuti pipettandoli su e giù con una pipetta da 1 mL 10x.
- Incubare le provette a 37 °C agitando costantemente a 100 giri/min per 30-45 minuti e controllare ogni 5-10 minuti per evitare la sovradigestione. Questo è fondamentale per migliorare la vitalità e la resa cellulare.
nota: Una buona digestione dei tessuti si tradurrà in un tessuto adiposo omogeneo, di colore giallo chiaro, visibile ad occhio nudo quando si fa roteare delicatamente il tubo.
- Arrestare la digestione aggiungendo 5 mL di HDMEM contenente il 10% di FBS e l'1% v/v di PS a RT e mescolare bene mediante pipettaggio.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a RT. L'SVF sarà visibile come una pallina brunastra. Aspirare con cura gli adipociti fluttuanti e decantare il surnatante rimanente senza disturbare la SVF. Sciogliere il pellet SVF in 10 mL di terreno di coltura e filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 5 mL di tampone di lisi eritrocitaria in una provetta conica da 15 mL per 10 min a RT.
- Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml di 1x PBS contenente l'1% di FBS. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di 1x PBS contenente l'1% di FBS.
- Centrifugare nuovamente le cellule a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura in una provetta conica da 15 mL a 4 °C.
- Dopo un ultimo ciclo di centrifugazione (500 x g per 5 minuti a 4 °C), risospendere le cellule pellettate in 5 mL di tampone FACS (PBS contenente il 10% di FBS, 100 unità/mL DNA I e l'1% v/v PS) su ghiaccio e contare le cellule con un emocitometro.
2. Isolamento dei NCADSC da parte del FACS
- Configurare e ottimizzare il selezionatore di celle seguendo il manuale di istruzioni. Selezionare l'ugello da 100 μm, sterilizzare le provette di raccolta, installare il dispositivo di raccolta richiesto e impostare i flussi laterali.
- Per lo smistamento delle celle RFP+, si consiglia un laser giallo/verde da 561 nm e un filtro ottico 579/16. Eseguire la compensazione utilizzando il controllo negativo e i controlli positivi a colorazione singola. Vedere la Figura 1A per lo schema di gating.
- Filtrare le cellule attraverso un colino da 40 μm, centrifugare a 500 x g per 5 minuti e risospenderle in 2 mL di tampone FACS a una densità di 0,5-1 x 107/mL. Trasferire le cellule in provette di polistirene a fondo tondo da 5 ml chiaramente etichettate e caricarle nello smistatore.
- Far funzionare la provetta sperimentale a 4 °C, accendere le piastre di deflessione e ordinarla in una provetta conica da 15 mL prerivestita con RPMI contenente l'1% di FBS e l'1% v/v PS.
nota: Proteggere i campioni dalla luce intensa per ridurre al minimo la tempra RFP.
3. Cultura dei NCADSC
- Piastra le cellule selezionate a una densità di 5.000 cellule/cm2 in una piastra di coltura a 12 pozzetti in terreno di coltura completo e incubazione a 37 °C in un'atmosfera umida con il 5% di CO2 per 20-24 ore.
- Rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS preriscaldato (37 °C) per rimuovere i detriti cellulari e aggiungere terreno di coltura fresco.
