Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione di soluzioni sterili di poli-D-lisina (PDL) e laminina
- Almeno un giorno prima dell'isolamento cellulare, preparare la poli-D-lisina (PDL) e piastre rivestite di laminina.
nota: Sono state preparate sia piastre a 6 che a 12 pozzetti a seconda degli obiettivi sperimentali. Tipicamente, le piastre a 12 pozzetti sono state utilizzate per l'analisi quantitativa utilizzando western blot, mentre le piastre a 6 pozzetti sono state utilizzate per contenere vetrini coprioggetti autoclavati (sterili) per l'immunoistochimica. Sono state utilizzate piastre a 24 pozzetti per la coltura di cellule gliali enteriche (EGC) per l'imaging a flusso Ca2+.
- Diluire le soluzioni madre con acqua di coltura tissutale ultrapura, priva di DNasi e RNasi in una cappa di coltura tissutale con aria filtrata HEPA.
- Vetrini coprioggetti sterilizzanti
- Tenere il vetrino coprioggetti con una pinza sterile e immergere i vetrini coprioggetti in un becher di etanolo al 100% per 15 minuti. Lasciare evaporare l'etanolo nella cappa di coltura tissutale e quindi posizionarlo nelle piastre a 6 pozzetti.
- In alternativa, posizionare più vetrini coprioggetti singolarmente su carta assorbente di 2 mm di spessore in un contenitore di plastica e poi sterilizzare in autoclave.
2. Piastre di rivestimento
NOTA: Esegui questi passaggi sotto una cappa a flusso laminare sterile per colture tissutali.
- Scongelare 1 mg/mL di PDL e diluire 1:10 con acqua sterile di coltura tissutale in modo che la concentrazione finale sia di 100 μg/mL. Utilizzare 2 mL per pozzetto per rivestire le piastre a 6 pozzetti, 1 mL per coprire un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e 0,5 mL per un pozzetto nelle piastre a 24 pozzetti. Conservare il PDL diluito rimanente in aliquote da 12 mL a -20 °C.
- Dopo aver lasciato che il PDL ricopra i pozzetti per almeno 1 ora, rimuovere il PDL con una pipetta sterile. Lasciare asciugare completamente le piastre all'aria sotto una cappa a flusso laminare per colture tissutali.
nota: Dopo aver rimosso la soluzione PDL con una pipetta sterile, può essere utilizzata altre due volte entro 1 settimana dopo essere passata attraverso un filtro da 0,22 μm e conservata a 4 °C.
- Scongelare la pasta di laminina sul ghiaccio per evitare la formazione di gel.
nota: La laminina non diluita diventa solida quando viene riscaldata a una temperatura superiore a 8 °C.
- Diluire la pasta di laminina (0,5 mg/mL) 1:50 con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco sterile (DPBS) per ottenere una concentrazione finale di 10 μg/mL. Conservare la laminina diluita in aliquote da 12 mL a -20 °C.
- Aggiungere la laminina diluita ai pozzetti contenenti PDL essiccato. Utilizzare 1 mL per coprire la superficie a 6 pozzetti e 0,5 mL per coprire il fondo delle piastre a 12 pozzetti. Per i vetrini coprioggetti, aggiungere 400 μl di laminina diluita ai vetrini coprioggetti per ottenere una copertura superficiale.
- Incubare le piastre rivestite a 37 °C per 2 ore, se la piastra viene utilizzata lo stesso giorno (rivestimento rapido). In caso contrario, sigillare le piastre con pellicola trasparente e conservarle per una notte a 4 °C (rivestimento lento).
nota: La sigillatura è fondamentale per evitare l'essiccazione e la contaminazione.
- Rimuovere con cura la soluzione di laminina con una pipetta per evitare di graffiare la superficie. Lavare delicatamente i pozzetti tre volte con DPBS sterile.
- Aggiungere un terreno di coltura gliale completo a ciascun pozzetto e mantenere le piastre a 37 °C fino al momento di aggiungere la sospensione EGC.
nota: Le piastre rivestite di lisina e laminina Poly-D possono essere conservate per 3 giorni a 4 °C. Rivestire le piastre con diversi giorni di anticipo e poi conservarle a 4 °C; lavare le piastre con soluzione salina tamponata con fosfato sterile di Dulbco (DPBS) tre volte. Aggiungere 2 ml di DPBS sterile in ciascun pozzetto dopo il lavaggio finale. Sigillare la lastra con parafilm e conservare a 4 °C. È essenziale assicurarsi che la laminina non si secchi.
3. Preparazione delle Soluzioni di Isolamento
- Preparare la soluzione di dissociazione EDTA/HEPES/DPBS. Per 500 mL di soluzione, utilizzare DPBS sterile (senza calcio e magnesio) per ottenere una soluzione finale di 10 mM di HEPES e 5 mM di EDTA. A 490 mL di DPBS, aggiungere 5 mL di tampone HEPES 1 M e 5 mL di soluzione madre EDTA 0,5 M. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Preparare il terreno di risospensione delle cellule gliali utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 1.
- Preparare i terreni di crescita gliale utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 2.
nota: I terreni di crescita gliali contenenti GDNF possono essere conservati per una settimana a 4 °C.
4. Rimozione del segmento intestinale
NOTA: Ai topi è stato permesso il libero accesso al cibo e all'acqua prima dell'eutanasia con il metodo della goccia di isoflurano e la rimozione di un organo vitale. Sono stati utilizzati topi C57BL/6 di età superiore a 8 settimane. Entrambi i sessi sono stati utilizzati senza differenze evidenti nella preparazione.
- Sopprimere il topo con un sovradosaggio di isoflurano e metterlo supino in un vassoio da dissezione. Appuntare le estremità e sterilizzare l'addome con etanolo al 70%. Tendi la pelle con una pinza e poi apri l'addome con le forbici.
- Sollevare il fegato e identificare lo stomaco distale/piloro. Quindi, rimuovere 7 cm di intestino prossimale. Fare attenzione a non strappare l'intestino.
- Tieni il piloro con il forcipe mentre tagli via il mesentere.
- Usa la dissezione smussata con la parte posteriore della forbice per raschiare via il pancreas aderente.
- Posizionare il segmento intestinale in DPBS ghiacciato senza Ca2+ o Mg2+ (Figura 1A).
nota: Anche altri segmenti dell'intestino o del colon possono essere rimossi utilizzando la stessa tecnica.
- Utilizzare una siringa da 5 o 10 ml collegata a un ago da 20 G con estremità smussata per sciacquare il contenuto fecale con DPBS ghiacciato (Figura 1B).
- Dividere l'intestino in segmenti di 3 cm per rimuovere il muscolo longitudinale. NOTA: I segmenti intestinali di un massimo di due topi vengono utilizzati per 30 ml di soluzione isolante HEPES/EDTA/DPBS.
- Spezzare circa 4 cm per separare il bastoncino di legno dalla punta di cotone. Immergere il bastoncino di legno in DPBS (Figura 1C).
- Infilare delicatamente uno dei segmenti intestinali sul bastoncino bagnato (Figura 2A-C).
- Rimuovere il mesentere aderente che è ancora attaccato utilizzando una pinza ad ago (Figura 2D).
- Utilizzare una lama di rasoio o un bisturi puliti per fare due incisioni longitudinali lungo l'intestino dove è stato attaccato il mesentere (Figura 2E).
- Bagnare la punta di cotone con DPBS. Strofinare la punta di cotone bagnata longitudinalmente lungo il muscolo per allentare il muscolo longitudinale/plesso mienterico (LMMP). Quindi, spostare la punta di cotone orizzontalmente per staccare l'LMMP dal muscolo circolare lungo la lunghezza del segmento intestinale durante la rimozione dell'LMMP.
- Tenere la punta del bastoncino tra il pollice e l'indice mentre si stabilizza il segmento con il medio e il quarto dito (Figura 2F). Al termine, l'LMMP si staccherà facilmente dal segmento intestinale.
- Scartare l'LMMP rimosso dal tubo intestinale e attaccato al batuffolo di cotone, a meno che non si desideri prelevare EGC dal plesso mioenterico.
- Utilizzare una lama di rasoio per aprire longitudinalmente il segmento intestinale per rimuoverlo dal bastoncino di legno.
- Conservare il tessuto intestinale spogliato (prevalentemente mucosa e sottomucosa più muscolo circolare) in DPBS su ghiaccio. Ripetere i passaggi 4.4-4.11 fino a quando tutti i segmenti intestinali sono preparati.
5. Rimozione della mucosa epiteliale
- Tagliare l'intestino in pezzi più piccoli di ~0,5 cm con le forbici sottili.
- Mettere il fazzoletto in una provetta da centrifuga conica sterile da 50 mL contenente 30 mL di soluzione EDTA/HEPES/DPBS ghiacciata.
- Agitare la soluzione contenente tessuto a 4 °C per 10 minuti a ~60 inclinazioni al minuto.
- Pre-inumidire una pipetta di plastica da 5 mL pipettando il tampone EDTA/HEPES/DPBS su e giù una volta, quindi utilizzare la pipetta pre-inumidita per pipettare il tessuto e la sospensione tampone su e giù (triturazione) 20 volte per rimuovere la mucosa epiteliale.
- Raccogliere il tessuto dall'incubazione dell'EDTA versando la miscela attraverso un colino cellulare di nylon da 100 μm. Scartare il flusso torbido pieno di muco (Figura 3).
- Inserire il tessuto trattenuto nel colino in una nuova provetta da centrifuga conica da 50 mL contenente 30 mL di EDTA/HEPES/DPBS ghiacciato utilizzando una pinza ad ago.
- Ripetere l'incubazione EDTA/HEPES/DPBS una seconda volta facendo oscillare il tessuto a 4 °C per 10 minuti a ~60 inclinazioni al minuto per rimuovere ulteriore mucosa epiteliale.
- Pre-inumidire una pipetta da 5 ml con il tampone, quindi pipettare la sospensione tissutale su e giù 20 volte per rimuovere le cellule mucose.
nota: Il tessuto tenderà ad attaccarsi all'interno della pipetta man mano che viene rimosso più epitelio.
- Raccogliere il tessuto dopo la seconda incubazione versando la miscela attraverso un colino cellulare di nylon da 100 μm ed espellere il flusso. Il secondo flusso dovrebbe essere notevolmente meno torbido del primo (Figura 3).
- Ripetere le incubazioni di 10 minuti con EDTA fino a quando la soluzione non è quasi limpida (circa 3 o 4 incubazioni a seconda della quantità di tessuto e dell'efficacia della triturazione) (Figura 3).
6. Raccolta di cellule gliali enteriche dalla lamina propria e dalla sottomucosa
- Trasferire il tessuto dal filtro di nylon a una provetta da centrifuga conica da 15 mL contenente 5 mL della soluzione di recupero cellulare disponibile in commercio e agitare per 25-30 minuti a 4 °C.
- Triturare delicatamente 10 volte per dissociare le cellule gliali enteriche dalla lamina propria.
- Filtrare attraverso un filtro da 40 μm e raccogliere il filtrato in una provetta pulita da 50 mL.
- Sciacquare il fazzoletto sul filtro di nylon con 1 mL di DPBS.
- Scartare il fazzoletto e trasferire i ~5-6 mL di filtrato in una provetta da centrifuga conica da 15 mL pulita.
- Centrifugare il filtrato a 2.000 x g in una centrifuga a secchiello oscillante per 5 minuti a 4 °C.
- Risospendere il pellet contenente cellule gliali in almeno 1 mL di tampone di risospensione pipettando delicatamente il pellet su e giù con un puntale per pipetta da 500 μL. Evita di introdurre bolle.
nota: Regolare il volume di risospensione secondo necessità per il numero di pozzetti e piastre. Ad esempio, 1,2 mL per una piastra a 6 pozzetti, 2,4 mL per due piastre a 6 pozzetti, 2,4 mL per una piastra a 12 pozzetti.
- Pipettare 200 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto dei 6 pozzetti o 100 μl per piastre rivestite di laminina PDL a 12 pozzetti contenenti terreni di crescita gliali.
- Non disturbare le piastre dopo aver aggiunto le cellule alle piastre e averle messe nell'incubatore a 37 °C per consentire l'adesione del numero massimo di cellule.
nota: Una preparazione sana di cellule si attaccherà entro 6-8 ore, ma attendere almeno 24 ore prima di cambiare il terreno pipettando delicatamente il terreno insieme alle cellule non aderenti.
- Utilizzare le cellule per gli esperimenti 3-4 giorni dopo che sono state messe in coltura (Figura 4).
Tabella 1. Composizione dei mezzi di risospensione delle cellule gliali.
| Componenti | Volume da aggiungere | Concentrazione finale |
| DMEM/F12 | 44,5 ml | _ |
| Siero fetale bovino (FBS) | 5 ml | 10% |
| Penicillina-Streptomicina | 500 μl | Penna da 100 UI/mL |
| streptomicina | | 100 μg/mL di streptococco |
| Gentamicina (50 mg/mL di brodo) | 20 μl | 20 μg/mL |
Tabella 2. Composizione dei terreni di crescita delle cellule gliali
| Componenti | Volume da aggiungere | Concentrazione finale |
| DMEM/F12 | 44 ml | _ |
| Siero fetale bovino (FBS) | 5 ml | 10% |
| Penicillina-Streptomicina (100x) | 500μl | 100 UI/mL (penna) |
| 100 μg/mL (Streptococco) | | |
| Gentamicina (50 mg/mL di brodo) | 20 μl | 20 μg/mL |
| GDNF (10 μg/mL stock) | 50 μl | 10 ng/mL |
