Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Purificazione dei capillari cerebrali suini
- Raccogli 8-10 cervelli da maiali domestici di 5-6 mesi (ad esempio da un macello vicino) e trasportali su ghiaccio in laboratorio. Si consiglia di iniziare la seguente procedura di purificazione entro 2-3 ore dalla cessazione dell'animale.
- Posizionare i cervelli in un banco di flusso sterile e lavarli delicatamente con 1 L di PBS in un becher posto sul ghiaccio.
- Rimuovere con cura le meningi da un cervello alla volta utilizzando una pinza a punta fine e trasferire i cervelli privi di meningi in un altro becher da 1 litro con PBS posizionato sul ghiaccio. Prolungare il tempo impiegato può complicare la rimozione. Il tempo approssimativo utilizzato per ogni cervello dovrebbe essere di 10-15 minuti.
- Usando un bisturi, raschiare via la materia grigia da un cervello alla volta e trasferire il materiale isolato in piastre di Petri (8,8 cm2) contenenti 20 ml di miscela di nutrienti DMEM F-12 (DMEM/F-12) poste su ghiaccio. Isolare quanta più materia grigia possibile senza prelevare materiale di sostanza bianca. Per la frammentazione iniziale, far passare il materiale della sostanza grigia attraverso una siringa da 50 ml senza ago. Continua per tutti i cervelli e metti in comune il materiale di materia grigia raccolto. Prolungare il tempo impiegato può complicare la rimozione. Il tempo approssimativo utilizzato per ogni cervello dovrebbe essere di 10-15 minuti.
- Trasferire il materiale isolato della sostanza grigia nel tubo di macinazione di un omogeneizzatore di tessuti portatile in un rapporto di 50/50 con terreni DMEM/F-12. Omogeneizzare il materiale facendo 8 colpi su e giù con un pestello sciolto, seguiti da 8 colpi su e giù con un pestello stretto. Continuare fino a quando tutto il materiale isolato non è stato omogeneizzato, quindi trasferire l'omogenato in un flacone da 500 ml e diluire con DMEM/F-12 fino a ottenere un volume totale di circa 450 ml.
- Filtrare l'omogeneizzato utilizzando un flacone da 500 ml con tappo blu con portafiltro e rete filtrante da 140 μm e isolare i capillari facendo passare il tessuto attraverso il filtro. Utilizzare un filtro per 50 ml di omogeneizzato e successivamente lavare ogni filtro con DMEM/F-12.
- Collocare i filtri contenenti capillari in piastre di Petri con una soluzione digestiva di tripsina/EDTA (2,5% di tripsina, 0,1 nM di EDTA in PBS), collagenasi CLS2 (2.000 U/mL) e DNasi 1 (3.400 U/mL) in DMEM/F-12. Utilizzare 1 piastra di Petri (8,8 cm2, 20 mL di soluzione) per 3 maglie filtranti.
- Posizionare le piastre di Petri a 37 °C per 1 ora su uno shaker orbitale a 180 giri/min o mescolarle delicatamente ogni 10 minuti. Dopo 1 ora, lavare i capillari dai filtri con la sospensione dalla piastra di Petri utilizzando una pipetta da 1 mL.
- Dividere la sospensione dalle 3 piastre in 2 provette da 50 ml e interrompere la digestione aggiungendo 10 ml di DMEM/F-12 a ciascuna provetta da 50 ml.
- Centrifugare le sospensioni cellulari a 250 x g, 4 °C per 5 minuti. Aspirare i surnatanti e risospendere ogni pellet in 10 mL di DMEM/F-12. Aggiungere altri 20 mL di DMEM/F12 a ciascuna provetta. Ripetere questo passaggio di centrifuga due volte.
- Lasciare raffreddare le provette con ghiaccio per 5 minuti e trasferire le soluzioni in 2 nuove provette da 50 mL.
- Centrifugare le sospensioni cellulari a 250 x g, 4 °C per 5 minuti e risospendere ogni pellet in 8-10 mL (circa 1 mL/cervello utilizzato) di soluzione di congelamento costituita dal 10% di DMSO in FBS.
- Trasferire la sospensione cellulare in crioviali, utilizzando 1 mL per crioviale. In media, la purificazione si traduce in 1 fiala per ogni cervello utilizzato, fornendo in media cellule endoteliali per 12-16 inserti. Porre i flaconcini in una scatola di congelamento a -80 °C per almeno 4 ore fino a tutta la notte. Successivamente, conservare i crioviali in un crioserbatoio con azoto liquido.
cautela: L'azoto liquido ha temperature estremamente basse. Si prega di indossare una protezione adeguata.