Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto. Il flusso procedurale per il protocollo è illustrato nella Figura 1.
1. Configurazione della procedura
- Preparare il tampone dei microvasi cerebrali (BMB). Iniziare pesando 54,66 g di D-mannitolo, 1,90 g di EGTA (glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico) e 1,46 g di base di 2-ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propandiolo (cioè Tris) in un becher pulito. Aggiungere 1,0 L di acqua deionizzata. Miscelare i componenti del tampone BMB utilizzando un agitatore magnetico. Una volta che la soluzione è stata accuratamente miscelata, regolare il pH a 7,4 utilizzando 1,0 M HCl.
- Preparare una soluzione di destrano al 26% (MW 75.000) (p/v) prima di anestetizzare gli animali. Seguire i seguenti passaggi per preparare la soluzione di destrano.
nota: È di fondamentale importanza preparare questa soluzione in anticipo perché il destrano può impiegare circa 1,5-2 ore per dissolversi in un tampone acquoso.
- Pesare il destrano in polvere (26 g per tampone da 100 ml) in un becher pulito.
- Misurare il volume appropriato di BMB ed erogarlo in un becher separato e pulito.
- Versare lentamente il BMB nel becher contenente destrano in polvere. Durante la mescita del BMB, mescolare manualmente il destrano in polvere utilizzando un'asta di vetro.
- Regolare il pH a 7,4 con 1,0 M di HCl immediatamente prima dell'uso.
nota: Un tipico isolamento di microvasi cerebrali da 12 singoli ratti Sprague-Dawley (maschi o femmine; 3 mesi di età; 200-250 g ciascuno) richiede 200 mL di soluzione di destrano (cioè, 52 g di destrano in 200 mL di BMB).
2. Estrazione di tessuto cerebrale da ratti Sprague-Dawley
- Dopo il trattamento sperimentale desiderato, anestetizzare i ratti Sprague-Dawley utilizzando ketamina (50 mg/kg; 2,5 ml/kg i.p.) e xilazina (10 mg/mL; 2,5 mL/kg i,p.). Diluire la ketamina e la xilazina in soluzione salina allo 0,9% fino a concentrazioni finali rispettivamente di 20 mg/mL e 4,0 mg/mL. Eutanasia degli animali mediante decapitazione utilizzando una ghigliottina affilata in conformità con le linee guida IACUC (Institutional Animal Care & Use Committee). Utilizzare la stessa procedura sia per i ratti Sprague-Dawley maschi che per le femmine.
- Reseca la pelle dal cranio del ratto facendo un singolo taglio trasversale usando le forbici chirurgiche.
- Usando rongeur, rimuovi con cura la placca cranica ed esponi il cervello.
- Rimuovere il cervello usando una spatola. Staccare il cervello e posizionare il tessuto cerebrale isolato in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di BMB. Aggiungere 1,0 μL di cocktail di inibitori della proteasi per 1,0 mL di tampone BMB immediatamente prima dell'uso.
3. Elaborazione del cervello
- Trasferire il tessuto cerebrale dalla provetta conica da 50 ml in una capsula di Petri pulita.
- Usando una pinza, arrotolare delicatamente il cervello su carta da filtro di 12,5 cm di diametro per rimuovere le meningi esterne, che aderiscono liberamente alla corteccia cerebrale. Premere delicatamente il tessuto cerebrale contro la carta da filtro e arrotolare nuovamente il fazzoletto. Girare frequentemente la carta da filtro durante questo passaggio.
- Separare il plesso coroideo dagli emisferi cerebrali utilizzando il forcipe.
nota: Il plesso coroideo appare come un chiaro tessuto membranoso localizzato sulla superficie dei ventricoli cerebrali.
- Appiattire delicatamente il tessuto cerebrale e rimuovere le meningi rimanenti e i bulbi olfattivi usando una pinza.
- Metti il tessuto cerebrale corticale in un mortaio di vetro freddo. Aggiungere 5,0 ml di BMB contenente cocktail di inibitori della proteasi al mortaio.
- Utilizzando un omogeneizzatore di potenza dall'alto, omogeneizzare il tessuto cerebrale utilizzando 15 corse su e giù a 3.700 giri/min. Eseguire l'omogeneizzazione utilizzando un mortaio da 10 ml e un tritatutto. Tra l'omogeneizzazione di ogni singolo campione, pulire il pestello utilizzando etanolo al 70%.
nota: I colpi di omogeneizzazione dovrebbero essere coerenti in termini di ritmo e grandezza.
- Versare l'omogeneizzato in provette da centrifuga etichettate.
4. Fasi di centrifugazione
- Aggiungere 8,0 mL di soluzione di destrano al 26% a ciascuna provetta da centrifuga marcata contenente l'omogeneizzato cerebrale.
- Capovolgere il tubo due volte e quindi agitare accuratamente il campione. Condurre il vortice di ciascun campione utilizzando più angolazioni per garantire una miscelazione accurata della soluzione di omogeneizzato cerebrale con la soluzione di destrano al 26%.
- Centrifugare campioni a 5.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
nota: Per alcune analisi, è utile confrontare i microvasi cerebrali con il parenchima cerebrale. Nel caso in cui fosse necessaria la valutazione dell'espressione proteica nel parenchima cerebrale, il surnatante di questa fase di centrifugazione (cioè la frazione parenchimale cerebrale) può essere raccolto e conservato a -80 °C per un uso futuro.
- Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto e una pipetta di vetro Pasteur.
nota: Bisogna fare attenzione a non disturbare il pellet. In caso contrario, la quantità di microvasi cerebrali raccolti sarà ridotta, il che ridurrà significativamente la resa proteica da questa procedura.
- Risospendere il pellet in 5,0 mL di cocktail di inibitori della proteasi contenente BMB (ovvero, 1,0 μL di cocktail di inibitori della proteasi per 1,0 mL di tampone BMB). Agitare il pellet per garantire una miscelazione accurata.
- Aggiungere 8,0 mL di destrano al 26% a ciascuna provetta da centrifuga e vortice come descritto nei passaggi 4.1-4.2 di questo protocollo.
- Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Utilizzando un pallone sottovuoto e una pipetta di vetro, aspirare il surnatante e assicurarsi che il pellet contenente il microvaso cerebrale non venga interrotto.
nota: Il materiale in eccesso che ha aderito alla parete del tubo non contiene microvasi e deve essere accuratamente pulito e rimosso.
- Ripetere i passaggi da 4.5 a 4.8 altre due volte.
- Una volta completate le 4 fasi di centrifugazione del destrano, aggiungere 5,0 mL di BMB a ciascun pellet e agitare per risospendere il campione.
nota: Dopo il completamento della fase 4.10, è possibile raccogliere microvasi interi per l'analisi della localizzazione delle proteine. Ciò può essere ottenuto prendendo un'aliquota di 50 μl di pellet di microrecipienti risospeso e spalmandolo su un vetrino da microscopio. I microrecipienti vengono quindi fissati a caldo a 95 °C per 10 minuti su un blocco riscaldante, seguiti dalla fissazione in etanolo ghiacciato per altri 10 minuti. I vetrini possono quindi essere conservati a 4 °C fino a quando non sono necessari per gli studi di imaging.
