Generazione di neuroni piramidali corticali da cellule staminali neurali umane

Abstract

Fonte: Gouder, L., et al,. Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da neuroni piramidali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video descrive un metodo per preparare vetrini coprioggetti rivestiti con poliornitina e laminina per migliorare l'adesione e la crescita delle cellule staminali neurali. La tecnica prevede incubazioni e lavaggi sequenziali, facilitando la formazione di una matrice di supporto che promuove la crescita e la differenziazione delle cellule neuronali, imitando le strutture presenti nei neuroni.

Protocollo

1. Cultura neuronale
   nota: La riprogrammazione dei fibroblasti nelle cellule staminali pluripotenti, l'impegno nel lignaggio del telencefalo dorsale, la derivazione, l'amplificazione e il banking dei progenitori corticali tardivi (LCP) sono stati descritti in Boissart et al. La differenziazione neuronale di cellule LCP-like è stata eseguita anche secondo Boissart et al. con lievi modifiche. Altre procedure sono state sviluppate per la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti indotte, seguita dalla loro differenziazione in neuroni. Questo protocollo è stato mantenuto poiché consente la produzione selettiva di neuroni glutammatergici piramidali.
   1. Trattare piastre di coltura a 6 pozzetti con vetrini coprioggetti con poliornitina (diluita a 1/6 in DPBS (Dulbecco s Phosphate Buffered Saline), concentrazione madre 0,01%) O/N, seguita da tre lavaggi in DPBS. Quindi aggiungere la laminina (concentrazione madre 1 mg/ml, diluita 500 volte in DPBS) per almeno 10 ore sotto la cappa di flusso.
   2. Piastra e invio di NSC a bassa densità (50.000 cellule/cm²) in piastre di coltura a 6 pozzetti con vetrini coprioggetti in 3 ml di terreno di coltura costituito da DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/F12 (500 ml), 2 fiale (5 ml ciascuna) di integratore di N2, 2 fiale (10 ml ciascuna) di integratore di B27, 10 ml di Pen-Streptomycin (Penicillina = 10.000 unità/ml e Streptomicina = 10.000 unità/ml), 1 ml di 2-mercaptoetanolo (Soluzione madre: 50 mM) e laminina (1/500), senza fattori di crescita. PASSAGGIO CRITICO: Eseguire questo passaggio con attenzione aggiungendo celle con movimenti rotatori lenti per ridurre l'aggregazione delle cellule.
   3. Rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere un terreno fresco N2B27 contenente 2 μg/ml di soluzione di laminina fresca per mantenere il neurone attaccato ai vetrini coprioggetti ed evitare la formazione di grumi. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Conservare una parte del terreno rimanente (200 μl) prima di aggiungere il terreno fresco per evitare che la cella si secchi. In alternativa, procedere rapidamente e modificare il volume totale (3 ml).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PD-PBS (1X), senza Calcio, Magnesio et Rosso fenolo	Gibco/ Tecnologie per la vita	14190169
Bioreagente in soluzione di poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	P4957
Lamina di topo	Dutscher Dominique	354232
Supplemento N2	Gibco/ Tecnologie per la vita	17502048
Integratore B-27 senza vitamina A (50X)	Gibco/ Tecnologie per la vita	12587010
DMEM/DADO. MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Tecnologie per la vita	31331028
Medicina neurobasale SFM	Gibco/ Tecnologie per la vita	21103049
2-mercaptoetanolo	Gibco/ Tecnologie per la vita	Codice 31350-010
Penna-Steptomicina	Gibco/ Tecnologie per la vita	Codice: 15140-122
Vetro di copertura 13 mm	VWR	Codice 631-0150
Reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPI	Gibco/ Tecnologie per la vita	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, liquido viscoso	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Fibroblasti umani	Biorepository di linee cellulari di Coriell	GM 4603 e GM 1869	Istituto Coriell per la ricerca medica, Camden, NJ, USA
Incubatore a CO2
Piastre di coltura a 6 pozzetti
Piptette