Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione e rimozione del cervello dal topo per affettare
- Preparare per la perfusione e l'incubazione a fette.
- Circa 30 minuti prima dell'affettatura, preparare una soluzione di taglio ad alto contenuto di saccarosio e liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) a basso contenuto di calcio per l'incubazione della fetta prima della registrazione o dell'imaging.
- Disporre tutti gli strumenti necessari (forbici grandi con estremità smussata, piccole forbici a molla, pinze anatomiche, forbici grandi o ghigliottina, forbici per iris, pinze da gioielliere, siringa da 10 ml con ago da 27 G x 1/2 pollici, piccolo pezzo di carta da filtro da 1 cm x 2 cm e una pipetta Pasteur con punta rotta per il trasferimento delle fette) per la perfusione e l'affettatura, e preparare il vassoio di perfusione.
- Impostare la camera di incubazione con aCSF ossigenato in un bagno d'acqua a 32 oC e una piastra di coltura riempita con soluzione di taglio.
- Preparare la fase di taglio per l'affettatura.
- Tagliare un pezzetto di agar al 3% di circa 1 cm3 da utilizzare come antiritorno per il cervello e 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm per una protuberanza da utilizzare per sostenere il collicolo inferiore (IC).
- Incollare il backstop sul palco con adesivo cianoacrilato e la protuberanza sul lato destro del backstop in modo che formino un angolo di 80o.
- Rimuovi il cervello.
- Anestetizzare profondamente un topo postnatale dal giorno 12 al giorno postnatale 20 (p12-p20, idealmente p14-18) con ketamina 100 mg/kg e xilassina 3 mg/kg (o procedura analoga approvata dal comitato etico).
nota: Confermare il corretto livello di anestesia tramite la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. Poiché l'animale viene brevemente sottoposto ad anestesia, l'unguento oftalmico non è necessario.
- Usando le forbici smussate, esporre la gabbia toracica dal processo xifoideo al collo.
- Trova il processo xifoideo e fai un taglio orizzontale di circa 1,5 cm.
- Eseguire due tagli verticali dalle estremità del precedente taglio orizzontale fino alle spalle, di circa 1,5 cm ciascuno.
- Tagliare il diaframma e le giunzioni costocondrali per esporre il cuore.
- Con piccole forbici a molla, fai un piccolo taglio di 2-5 mm nell'atrio destro, dal lato ventrale a quello dorsale del cuore.
- Utilizzando una siringa da 10 ml con un ago da 27 G x 1/2 pollici, iniettare il ventricolo sinistro e perfondere rapidamente l'animale con una soluzione di taglio ad alto contenuto di saccarosio.
- Una volta che il sangue scorre limpido, usa le forbici più grandi per rimuovere la testa.
nota: Non abbiamo valutato sistematicamente l'utilità della perfusione. Tuttavia, nella nostra esperienza, la perfusione transcardiaca in topi così giovani può essere eseguita con quasi il 100% di successo e ha il vantaggio di eliminare i globuli rossi, che possono emettere fluorescenza e interferire con l'imaging.
- Taglia la pelle lungo la linea mediana per esporre il cranio.
- Utilizzando le forbici dell'iride piegate, tagliare il cranio tra gli occhi, quindi partendo dal taglio tra gli occhi, tagliare accuratamente da anteriore a posteriore lungo la sutura della linea mediana facendo attenzione a non danneggiare il cervello sottostante.
nota: La dura madre di solito si stacca con il cranio. Se necessario, rimuovere la dura madre prima di rimuovere con cura il cervello.
- Usando una pinza da gioielliere, fai leva per aprire il cranio e rimuovere con cura il cervello, quindi posiziona il cervello nella soluzione di taglio. Fare attenzione a non danneggiare le cortecce artificiali.
2. Preparare il cervello per affettare
- Preparazione del cervello per il montaggio sul palco del vibratomo.
- Utilizzando un vetrino contrassegnato da due linee a 90o e una linea diagonale a 17o dall'alto a sinistra al basso a destra, intersecandosi dove le due linee si incontrano, posizionare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto, utilizzando una lama di rasoio, rimuovere 2-4 mm dell'estremità rostrale del cervello creando una superficie piana.
- Posiziona il cervello con il lato caudale rivolto verso l'alto sulla superficie piana appena creata e allinea la superficie dorsale del cervello con l'orizzontale e la linea mediana del cervello con la linea verticale.
- Allineare la lametta con la linea delle 17, inclinare il rasoio con un angolo di 30o e rimuovere circa 3 mm della corteccia destra in un doppio taglio diagonale (17o dal piano orizzontale e 60o dalla corona).
- Montaggio del cervello sul palco del vibratomo.
- Posizionare un piccolo pezzo di carta da filtro di 1 cm x 2 cm sul lato ventrale del cervello in modo che la dimensione lunga sia perpendicolare alla linea mediana.
- Applicare con cura una piccola quantità di adesivo cianoacrilato sull'area davanti al backstop (e a sinistra della protuberanza).
- Posiziona la faccia del cervello tagliata in diagonale sulla colla in modo che la parte caudale del cervello e il rombencefalo siano appoggiati sulla protuberanza e il lato destro del cervello sia contro il backstop.
- Premere delicatamente sul cervello, assicurandosi che l'intera superficie sia a contatto con la camera di affettamento.
3. Ottenere la fetta collicolo-talamocorticale
- Prendere rapidamente la fase di taglio e posizionare nel vibratomo, riempire la fase con la soluzione di taglio.
- Allineare la lama con la parte superiore (lato ventrale) del cervello.
- Rimuovere 1-1,5 mm dalla parte superiore del cervello, rimuovere fette da 300-500 μm e valutare la profondità dopo la rimozione.
Nota: quando l'IC, il corpo genicolato mediale (MGB) e il nucleo genicolato laterale (LGN) sono tutti visibili e il giro dentato forma una forma a "C", prendi da una a due fette da 600 μm. Vedere la Figura 1A.
- Mettere le fette nella camera di contenimento riscaldata (32 oC).
