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1. Preparazione di piastre rivestite di matrice extracellulare (ECM)
- Diluire l'ECM (vedi Tabella dei materiali) con 1x PBS ghiacciato fino a una concentrazione finale del 2%
- Aggiungere 1 mL di ECM a 49 mL di 1x PBS in una provetta di plastica da 50 mL. Mescolare bene pipettando su e giù più volte.
- Mettere 1 vetrino coprioggetti in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 1,5 mL di ECM al 2% in ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra a pozzetti con ECM al 2% per 2 ore a 37 °C.
- Aspirare l'ECM dalla piastra a pozzetti e conservare la piastra a 4 °C prima dell'uso.
2. Differenziazione delle iPSC verso NMJ
- Seminare 4 x 105 di iPSC per pozzetto sulla piastra a 6 pozzetti preparata nella sezione 1. Assicurati di seminare le cellule sul vetrino coprioggetti pre-depositato nel pozzo.
nota: In questo studio è stata utilizzata la linea cellulareMYOD iPS 201B7.
- Rimuovere il terreno dalle iPSC sul piatto di coltura da 6 cm e lavare le iPSC una volta con 1x PBS.
- Aggiungere 1 mL di soluzione per il distacco cellulare alla piastra e incubare per 10 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 3 mL di terreno di cellule staminali embrionali (ES) di primati alla piastra e pipettare delicatamente 3 volte.
- Raccogliere il surnatante, che contiene iPSC staccate, in una provetta di plastica da 50 ml e centrifugare a 160 x g a 4 °C per 5 minuti.
- Aspirare con cautela il surnatante, risospendere le iPSC in 3 mL di terreno di cellule ES di primati con 10 μM di Y27632 e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Diluire le iPSC con terreno di cellule ES di primati e 10 μM di Y27632 a una concentrazione di 2 x 105 cellule/mL. Aggiungere 2 mL di iPSC sul vetrino coprioggetti predepositato nel pozzetto descritto nella sezione 1.
3. Induzione delle iPSC a NMJ
- Il giorno 1, 24 ore dopo aver seminato le iPSC sulla piastra a 6 pozzetti, rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con 2 mL di terreno di cellule ES di primati fresco contenente 1 μg/mL di doxiciclina per ciascun pozzetto.
- Sostituire il terreno con 2 mL di terreno di differenziazione miogenica (MDM) (Tabella 1) contenente 1 μg/mL di doxiciclina (concentrazione finale) in ciascun pozzetto. Aggiorna il mezzo ogni giorno dal giorno 2 al giorno 10.
- Dal giorno 11, passare il terreno a 2 mL di terreno NMJ (Tabella 1) in ciascun pozzetto. Aggiornare il mezzo ogni 3-4 giorni fino al giorno 30.
- Osservare l'NMJ differenziato mediante microscopia a fase invertita il giorno 30. L'NMJ può essere utilizzato per l'analisi successiva.