Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Configurazione sperimentale
- Prima di iniziare il prelievo di tessuti e cellule, verificare che tutti gli strumenti siano sterili. Se necessario, sterilizzare in autoclave un paio di forbici chirurgiche affilate, un paio di pinze molto sottili e un paio di pinze standard fini. Inoltre, a seconda dei casi, sterilizzare ciascun substrato prima della semina cellulare utilizzando la sterilizzazione UV, l'esposizione all'etanolo o la sterilizzazione a vapore.
- Preparazione di terreni e soluzioni stock per la raccolta e la dissociazione dei neuroni
- Preparare il terreno di Bottenstein e Sato (BS), aggiungendo l'1% di penicillina-streptomicina (PS) e l'1% di N2 al terreno F12 di Ham. Calcolare il volume finale necessario come 500 μl per pozzetto (se si utilizza una piastra a 24 pozzetti).
- Preparare le scorte di collagenasi IV nel terreno F12 di Ham alla concentrazione dell'1,25% in peso/v. Sterilizzare la soluzione con filtro e conservarla a -20 °C come aliquote da 200 μl.
- Preparare le scorte di tripsina pancreatica bovina nel terreno F12 di Ham alla concentrazione del 2,5% in peso/v, filtrare-sterilizzare e conservare a -20 °C come aliquote da 200 μl.
- Preparare la soluzione madre del fattore di crescita nervoso (NGF) alla concentrazione di 5 μg/mL in una soluzione di albumina sierica bovina (BSA) priva di acidi grassi (BSA) sterilizzata con filtro in terreno F12 e conservare a -20 °C come aliquote da 200 μl. Non filtrare l'NGF dopo la ricostituzione.
- Nel caso in cui non sia stata eseguita alcuna modifica della superficie, rivestire i vetrini/piastre con poli-D-lisina (0,1 mg/ml per 15 minuti a temperatura ambiente [RT]) e/o laminina (2-10 μg/cm2 per 2 ore a 37 °C) per supportare l'attacco dei neuroni e la crescita dei neuriti, a seconda dei casi.
- Riscaldare sempre il fluido a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso.
2. Raccolta e dissociazione dei neuroni dei gangli delle radici dorsali (DRG)
- Terminare il ratto mediante lussazione cervicale e decapitazione. Radere il ratto e sollevare la pelle per esporre la colonna vertebrale. Usando forbici affilate, asportare la colonna vertebrale prestando particolare attenzione agli organi confinati e ai vasi sanguigni. Trasferire la colonna vertebrale in una cabina di sicurezza biologica (classe II) utilizzando una capsula di Petri e rimuovere qualsiasi parte dorsale.
- Dividere la colonna vertebrale a metà lungo l'asse longitudinale utilizzando forbici chirurgiche sterili e affilate per esporre il tessuto del midollo. A questo punto, è utile tagliare la colonna vertebrale in due segmenti più piccoli sotto il livello della gabbia toracica, per renderla più facile da maneggiare durante il prelievo dei neuroni DRG. Utilizzando una pinza fine, rimuovere delicatamente tutto il tessuto del midollo, facendo attenzione a non tirare e rimuovere le radici DRG. In questo modo il DRG e le radici saranno esposti all'interno dei canali vertebrali, ancora racchiusi nella colonna. Osservare i DRG come filamenti bianchi che fuoriescono direttamente dai canali.
- Estrarre l'intera radice DRG (non solo il DRG) dai canali vertebrali utilizzando una pinza molto sottile, andando in profondità nei canali vertebrali e facendo attenzione a non danneggiare le radici dei gangli. Trasferire il DRG in una piccola capsula di Petri (60 mm2) contenente 3-4 ml di terreno F12 di Ham's integrato con l'1% di PS. Se si utilizzano animali diversi, utilizzare piatti separati.
- Sotto un microscopio da dissezione, pulire il DRG da eventuali eccessi di radici nervose che circondano i gangli utilizzando una pinza sterile e un bisturi per ridurre la contaminazione delle cellule gliali. Trasferire il DRG in una piccola capsula di Petri (35 mm2) con 1,8 ml di terreno F12 fresco.
- Aggiungere 200 μl di soluzione madre di collagenasi di tipo IV all'1,25% in peso/v (concentrazione finale dello 0,125%) e incubare il DRG a 37 °C, CO2 al 5% per 1 ora. Aspirare accuratamente il terreno con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non aspirare o danneggiare il DRG. Aggiungere un terreno F12 fresco integrato con l'enzima collagenasi di tipo IV allo 0,125% in peso/v e incubare per 1 ora come descritto in precedenza.
- Aspirare il fluido e lavare delicatamente il DRG con il mezzo F12. Aggiungere quindi 1,8 ml di terreno F12 e 200 μl di tripsina (concentrazione finale dello 0,25% in peso/v) e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 30 min.
- Rimuovere la tripsina e aggiungere 1 ml di terreno F12 integrato con 500 μl di siero fetale bovino (FBS) per arrestare la reazione enzimatica. Aspirare il terreno e lavare delicatamente il DRG con terreno F12 per tre volte per rimuovere le tracce di siero.
- Aggiungere 2 ml di terreno F12 fresco e trasferire con cura il DRG con il terreno in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta di vetro. Dissociare delicatamente i neuroni DRG pipettandoli su e giù (circa 8-10 volte) con la pipetta di vetro (in alternativa si possono usare puntali di plastica).
- Lasciare che il pellet si depositi sul fondo del tubo e raccogliere il fluido in un nuovo tubo. Aggiungere 2 ml di terreno F12 fresco alla provetta contenente il pellet e ripetere la dissociazione meccanica con la pipetta di vetro. Ripetere questo passaggio fino a quando la sospensione diventa omogenea (circa 3-4 volte) e raccogliere tutto il DRG dissociato nel nuovo tubo. Questo metodo riduce lo stress derivante dalla dissociazione meccanica e migliora la vitalità dei neuroni.
- Filtrare la sospensione omogeneizzata risultante in una nuova provetta da 15 ml utilizzando un filtro cellulare da 100 μm per rimuovere i neuroni non dissociati e altri detriti. A questo punto, potrebbe essere conveniente filtrare prima la sospensione cellulare in una provetta da 50 ml e poi trasferire la soluzione nella provetta più piccola utilizzando una pipetta di vetro. Centrifugare la sospensione a 110 g per 5 min.
- Preparare un BSA al 15% aggiungendo 500 μl di una soluzione di BSA al 30% a 500 μl di terreno F12. Pipettare lentamente la soluzione lungo la parete di una provetta da 15 ml per creare una scia proteica graduale. A questo punto, è utile tenere il tubo ad un angolo di 45° e rilasciare lentamente il BSA utilizzando i numeri sul tubo falcon come riferimento per la "pista" di formatura.
- Aspirare il surnatante dal passaggio 2.10 lasciando 500 μl sul fondo della provetta e risospendere il pellet di cella nello stesso mezzo. Pipettare lentamente la sospensione lungo la scia proteica precedentemente preparata al punto 2.11 (utilizzare come riferimento i numeri sulla provetta) e centrifugare a 500 g per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno BS modificato.
nota: Il volume per risospendere i neuroni DRG può essere aumentato fino al volume effettivo richiesto, a seconda della concentrazione cellulare finale desiderata e del numero di campioni da seminare. Un animale fornirà abbastanza cellule per un esperimento su piastra a 24 pozzetti.
- Incubare i campioni seminati a 37 °C, 5% di CO2 per 2 ore per consentire l'adesione delle cellule e infine aggiungere terreno BS fresco integrato con 50 ng/ml di NGF.
