Miglioramento della differenziazione delle cellule staminali con un trattamento transitorio con DMSO

Abstract

Fonte: Sambo, D. et al., Trattamento transitorio di cellule staminali pluripotenti umane con DMSO per promuovere la differenziazione. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra il metodo per migliorare la differenziazione delle cellule staminali con il trattamento transitorio DMSO, che arresta le cellule nella fase G1. Dopo il trattamento, viene aggiunto un mezzo di differenziazione ectodermica con inibitori di BMP e TGF-β per promuovere la formazione di precursori neurali.

Protocollo

1. Mantenimento delle cellule staminali

NOTA: Il protocollo di mantenimento cellulare descritto di seguito si applica alle cellule staminali pluripotenti (PSC) mantenute in un monostrato aderente. I terreni, gli altri reagenti e le piastre per colture cellulari utilizzati prima del trattamento con dimetilsolfossido (DMSO) possono essere regolati in base alle esigenze. Per tutti i seguenti protocolli in questo manoscritto, le cellule devono essere maneggiate sotto una cabina di sicurezza biologica.

1. Rivestire piastre sterili a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale con una matrice o un substrato qualificato per cellule staminali pluripotenti preparate secondo le istruzioni del produttore e incubare per almeno 1 ora in un incubatore di CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida). Le lastre rivestite possono essere avvolte in pellicola e conservate a 4 °C per un massimo di una settimana.
2. Scongelare le PSC crioconservate in un bagno d'acqua a 37 °C. Sterilizzare la fiala con etanolo prima dell'introduzione nella camera di sicurezza biologica, quindi trasferire immediatamente le cellule mediante pipettaggio in una provetta conica sterile contenente 5-10 volumi di terreno di coltura con cellule staminali preriscaldate.
3. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Aspirare il terreno e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura di cellule staminali integrato con un inibitore della proteina chinasi associata a rho (ROCK) da 10 μM, come l'Y-27632.
5. Aspirare la matrice di coltura dalla piastra e seminare le cellule alla densità desiderata, in genere 0,5-1 x 10⁶ cellule per pozzetto in almeno 2 mL di terreno di coltura per cellule staminali per pozzetto.
   nota: La densità di placcatura può variare tra le diverse linee cellulari e cloni e deve essere ottimizzata di conseguenza.
6. Mantenere le cellule sostituendole con terreni di coltura con cellule staminali preriscaldate ogni giorno. Dividi le cellule a circa il 70%-80% di confluenza o quando le colonie cellulari iniziano a entrare in contatto.
7. Per dividere le cellule, aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con soluzione fisiologica tamponata con fosfato sterile (PBS). Incubare le cellule con 1 mL di una soluzione di enzima di dissociazione per pozzetto per 5-10 minuti a 37 °C.
8. Lavare e risospendere le cellule con terreno di coltura di cellule staminali preriscaldato e trasferirle in una provetta conica sterile con 5-10 volumi di terreno di coltura di cellule staminali. Seguire i passaggi 1.3-1.7 per piastrare.

2. Pretrattamento DMSO

NOTA: Quando si colorano le cellule per il pretrattamento DMSO prima della differenziazione, la densità iniziale delle cellule di placcatura deve essere ottimizzata tenendo conto del tasso di crescita tipico della linea di cellule staminali e del protocollo di differenziazione utilizzato. Convalidare la pluripotenza utilizzando marcatori convenzionali, se necessario. Le cellule devono essere fatte passare almeno 1x-2x dopo lo scongelamento iniziale prima della differenziazione.

1. Differenziazione delle culture 2D
   1. Quando le cellule raggiungono una confluenza appropriata, preparare piastre rivestite, dissociare le cellule e preparare una sospensione a cellula singola come descritto sopra.
   2. Contare le cellule vive utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule, incluso il blu di tripano o un altro marcatore di vitalità.
   3. Piastra le cellule su una piastra rivestita a 6 pozzetti a 0,5-1 x 10⁶ cellule per pozzetto in terreno di coltura con cellule staminali con l'inibitore ROCK da 10 μM.
      NOTA: Per le linee cellulari testate nel nostro laboratorio, queste densità hanno tipicamente portato all'80%-90% di cellule confluenti entro il pretrattamento DMSO di 24 ore.
   4. Lasciare incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in un incubatore di CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida).
   5. Preparare l'1%-2% di DMSO in terreni di cellule staminali preriscaldati (ad esempio, 100 μL di DMSO in 10 mL di terreno = soluzione di DMSO all'1% o 200 μL di DMSO in 10 mL di terreno = soluzione di DMSO al 2%).
   6. Dopo 24 ore di incubazione, aspirare il terreno dalle cellule e sostituirlo con una soluzione di DMSO.
   7. Lasciare incubare le cellule per 24-48 ore a 37 °C in un incubatore di CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida) prima della differenziazione.
      NOTA: In genere, un trattamento con DMSO di 24 ore è sufficiente per la maggior parte delle linee di cellule staminali embrionali umane e di cellule staminali pluripotenti indotte (ESC e iPSC). Le linee cellulari con tassi di crescita molto lenti (lunghi tempi di raddoppio) possono beneficiare dell'incubazione di 48 ore con DMSO. Per un'incubazione di 48 ore con DMSO, i terreni possono essere sostituiti con terreni di cellule staminali freschi con DMSO all'1%-2% dopo le prime 24 ore di trattamento.

3. Differenziazione in strati germinali primari

NOTA: Quanto segue descrive i metodi precedentemente dimostrati efficaci nel nostro laboratorio per le PSC coltivate in monostrato su piastre a 6 pozzetti. Qualsiasi protocollo di differenziazione di scelta deve essere utilizzato dopo il trattamento con DMSO per promuovere la differenziazione nei lignaggi desiderati. Rimuovere la soluzione di DMSO dopo un trattamento di 24-48 ore e procedere con la differenziazione seguendo i protocolli standard.

1. Differenziazione dell'ectoderma
   1. Pretrattare le cellule con DMSO come descritto sopra per le colture 2D.
   2. Preparare Noggin e SB431542 soluzioni stock.
   3. Preparare i terreni di base di differenziazione ectodermica sciogliendo il siero di sostituzione knockout (KOSR) a una concentrazione finale del 10% in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) knockout.
      nota: Preparare una quantità sufficiente di supporti di base per 3-4 giorni di cambio dei supporti.
   4. Preparare i terreni di differenziazione ectodermica aggiungendo Noggin a una concentrazione finale di 500 ng/mL e SB431542 a una concentrazione finale di 10 μM al volume appropriato di DMEM KOSR/knockout preriscaldato.
   5. Dopo il pretrattamento con DMSO, aspirare il terreno dalle cellule e sostituirlo con un terreno di differenziazione (ad esempio, 2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti).
   6. Lasciare incubare le cellule per 3-4 giorni a 37 °C in un incubatore di CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida), sostituendo quotidianamente i terreni con fattori di differenziazione appena aggiunti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra per coltura cellulare multipozzetto a fondo piatto trasparente a 6 pozzetti trattata con TC	Corning	353046
Contacellule automatizzato Countess II FL	Thermo Fisher Scientifico	AMQAF1000
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Dmso	Sigma-Aldrich	D2650
Knockout DMEM	Gibco	10829018
Sostituzione del siero knockout	Gibco	10828028
Matrice Matrigel	Corning	354277
Noggin Fc Chimera Proteina	Sistemi di ricerca e sviluppo	3344-NG-050
SB431542	Stemgent	04-0010
Micropiastre ad attacco ultrabasso	Corning	3471
Y-27632	Tecnologie StemCell	Codice: 72302