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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione dei tamponi di dissezione e dei terreni di coltura
- Per l'isolamento del midollo spinale di ratto, preparare 100 ml di tampone di dissezione (1x PBS + 0,6% glucosio + 2% penicillina-streptomicina) e conservare in frigorifero.
- Preparare 100 ml di terreno senza siero (SFM) e scaldare a 37 °C. Per preparare la SFM, aggiungere 2 mM di L-glutammina, 100 μg/ml di penicillina-streptomicina, il 2% di B27 e il 10% di miscela ormonale al terreno Neurobasal-A. Per preparare la miscela ormonale, preparare un terreno DMEM/F12 1:1 contenente lo 0,6% di glucosio, 3 mM di NaHCO3, 5 mM di HEPES, 25 μg/ml di insulina, 100 μg/ml di apo-transferrina, 10 μM di putrescina, 30 nM di selenio e 20 nM di progesterone.
- Preparare il terreno di placcatura arricchito con fattore di crescita EFH (per SFM aggiungere 20 ng/ml di EGF, 20 ng/ml di bFGF e 2 μg/ml di eparina) e scaldare a 37 °C.
2. Raccolta e dissezione del tessuto del midollo spinale periventricolare di ratto adulto
- Sterilizzare gli strumenti di dissezione in etanolo e risciacquare in anticipo con soluzione fisiologica sterile o strumenti in autoclave. Somministrare ai ratti (6-8 settimane di età) un'iniezione letale di pentobarbital sodico (1 cc a 65 mg/ml) o un'overdose di anestetico (ad esempio, isoflurano al 4%) secondo il protocollo animale approvato dall'istituto. Bagnare la parte posteriore del ratto con etanolo al 70% e rimuovere la pelle sulla superficie dorsale con grandi forbici da dissezione.
- Tenendo le forbici perpendicolari alla superficie dorsale, tagliare trasversalmente la colonna vertebrale sopra gli arti posteriori. Usa forbici più piccole per tagliare longitudinalmente il muscolo dorsale sovrastante la colonna vertebrale in direzione rostrale per esporre i processi spinosi.
- Partendo dall'estremità caudale esposta, inserire dei rongeurs o un piccolo strumento smussato per tagliare l'osso extraduralmente nella faccia laterale del canale spinale nello spazio tra il midollo spinale e la colonna vertebrale. Praticare piccoli tagli nella lamina (archi ossei a sinistra e a destra dei processi spinosi su ciascun lato delle vertebre) e staccare con cura la lamina per esporre il midollo spinale (Figura 1A-D). Assicurarsi che l'angolo delle lame sia poco profondo e parallelo al midollo in modo che il midollo spinale sottostante non venga danneggiato.
- Continuare la laminectomia in direzione rostrale per esporre il midollo spinale toracico e cervicale.
- Asportare delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale con una pinza per tessuti smussata e utilizzare le microforbici per recidere accuratamente le radici per rilasciare il midollo. Porre il midollo spinale asportato in una capsula di Petri contenente un tampone sterile di dissezione per ratti a 4 °C (descritto sopra al punto 1.1). Sciacquare il fazzoletto in un tampone da dissezione a 4 °C appena preparato e tagliare il midollo spinale trasversalmente in segmenti di 1 cm utilizzando le forbici (Figura 1E).
- Per ogni segmento di tessuto, usa una mano per tenere il tessuto con una pinza sottile. Con l'altra mano, usa le microforbici per rimuovere con cura le meningi sovrastanti, la sostanza bianca e la maggior parte della materia grigia con l'aiuto di un cannocchiale da dissezione. In alternativa, utilizzare una pinza fine (Dumont #4) per rimuovere la maggior parte della sostanza grigia e bianca, lasciando solo la regione periventricolare del midollo spinale che include l'ependima e una piccola quantità di materia grigia circostante (Figura 1F-H).
- Raggruppare il tessuto periventricolare sezionato in una capsula di Petri sterile da 10 cm contenente un tampone di dissezione fredda per ratti.
3. Isolamento e coltura di NSPC adulti del midollo spinale di ratto
- Eseguire i seguenti passaggi in modo asettico in una cappa a flusso laminare.
- Tritare il tessuto periventricolare di ratto sezionato in pezzi di 1 mm con le microforbici.
- Dissociare enzimaticamente il tessuto tritato con enzimi proteolitici utilizzando il kit di dissociazione della papaina come indicato nella tabella dei materiali/reagenti.
nota: I componenti del reagente includono quattro fiale: Fiala 1: Soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS). Fiala 2: Papaina contenente L-cisteina e EDTA. Fiala 3: Desossiribonucleasi I (DNasi). Flaconcino 4: Inibitore della proteasi ovomucoide con albumina sierica bovina (BSA).
NOTA: La papaina è una proteasi sulfidrilica con un'ampia specificità per i substrati proteici. La papaina qui contenuta è derivata dal lattice della pianta Carica papaya e degrada la maggior parte dei substrati proteici in modo più esteso rispetto alle proteasi pancreatiche. Durante il processo di dissociazione, si verifica un danno cellulare che causa il rilascio di DNA nel mezzo di dissociazione, aumentando la viscosità e rendendo difficile il pipettaggio. Pertanto, la DNasi è inclusa nella procedura di isolamento cellulare per digerire il DNA senza danneggiare le cellule intatte. Gli ovomucoidi sono inibitori della proteasi glicoproteica utilizzati per inibire l'attività della papaina dopo la fase di dissociazione.
- Al primo utilizzo, ricostituire la miscela di inibitori dell'albumina ovomucoide (flaconcino 4) con 32 ml di EBSS (flaconcino 1), quindi conservare a 4 °C e utilizzare per i successivi isolamenti. nota: Questo produce una soluzione a una concentrazione efficace di 10 mg di inibitore degli ovomucoidi e 10 mg di albumina per ml.
- Aggiungere 5 ml di EBSS (flaconcino 1) al flaconcino di papaina (flaconcino 2), ottenendo una soluzione a 20 unità di papaina/ml in 1 mM di L-cisteina con 0,5 mM di EDTA. Verificare che la soluzione di papaina appaia limpida quando è completamente disciolta. In caso contrario, immergere il flaconcino in un bagnomaria a 37 °C per dieci minuti fino a quando la papaina non si sarà completamente sciolta per garantire la totale attività dell'enzima.
- Aggiungere 500 μl di EBSS (fiala 1) alla fiala di DNasi (fiala 3) e mescolare delicatamente poiché la DNasi è sensibile alla denaturazione da taglio. Aggiungere 250 μl della soluzione di DNasi al flaconcino di papaina, ottenendo una concentrazione finale di circa 20 unità/ml di papaina e lo 0,005% di DNasi. Conservare il DNAsi rimanente per utilizzarlo in seguito.
- Metti il tessuto di ratto tritato nella soluzione di papaina.
- Incubare a 37 °C con agitazione costante su una piattaforma a bilanciere per dissociare il tessuto nella soluzione di papaina attivata. Incubare il tessuto di ratto per 45 minuti a 1 ora.
- Triturare la miscela con una pipetta da 10 ml per dissociare eventuali pezzi di tessuto rimanenti e ottenere una sospensione cellulare torbida. Trasferire la sospensione cellulare (non includere pezzi di tessuto non dissociato) in una provetta conica sterile da 15 ml e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a RT.
- Risospendere le cellule pellettate in un terreno contenente ovomucoide, un inibitore della papaina.
- Preparare la soluzione di ovomucoide mescolando 2,7 ml di EBSS (flaconcino 1) con 300 μl della soluzione ricostituita di inibitore dell'albumina-ovomucoide (flaconcino 4) in una provetta conica da 15 ml. Aggiungere 150 μl di soluzione di DNasi (flaconcino 3).
- Scartare il surnatante dalle cellule pellettate e risospendere immediatamente il pellet cellulare nella miscela diluita DNasi-inibitore dell'albumina.
- Separare le cellule intatte dalle membrane cellulari mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo a passaggio singolo.
- Preparare il gradiente di densità discontinuo aggiungendo 5 ml di soluzione di inibitore dell'albumina (flaconcino 4) in una provetta da 15 ml e, utilizzando una pipetta da 5 ml, sovrapporre delicatamente e lentamente la sospensione cellulare (preparata come descritto sopra) sopra la soluzione di inibitore dell'albumina.
- Centrifugare a 70 x g per 6 minuti a RT.
nota: L'interfaccia tra i due strati del gradiente dovrebbe essere chiaramente visibile, anche se una miscelazione minima a questo limite non influisce sul risultato. I frammenti di membrana rimangono all'interfaccia e le cellule dissociate si ricoprono sul fondo del tubo.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno EFH di ratto (preriscaldato a 37 °C). Contare la densità delle cellule vive con un emocitometro e immergere le cellule in un pallone di coltura T25 a una densità di 10 cellule/μl in EFH. La resa tipica delle cellule da tessuto di ratto è di circa 2 x 106 cellule con circa l'80% di vitalità. Se si desidera coltivare colture clonali, seminare cellule con una densità inferiore a 10 cellule/μl. Incubare i palloni a 37 °C in CO2 al 5% e lasciare che le colture crescano indisturbate per 1 settimana per evitare l'aggregazione delle sfere.
