Isolamento delle cellule progenitrici dello staminali neurale dalla regione periventricolare del midollo spinale di un ratto adulto

Abstract

Fonte: Mothe, A., et al., Isolamento di cellule staminali/progenitrici neurali dalla regione periventricolare del ratto adulto e del midollo spinale umano. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video presenta un metodo per isolare le cellule staminali/progenitrici neurali dal tessuto periventricolare del midollo spinale nei ratti adulti. La tecnica prevede l'incubazione dei frammenti di tessuto in una soluzione contenente enzimi proteolitici per interrompere la matrice extracellulare e rilasciare le cellule. Successivamente, le cellule rilasciate vengono piastrate in un mezzo contenente specifici fattori di crescita che migliorano la proliferazione staminale/progenitrice neurale e promuovono l'aggregazione in neurosfere tridimensionali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione dei tamponi di dissezione e dei terreni di coltura

1. Per l'isolamento del midollo spinale di ratto, preparare 100 ml di tampone di dissezione (1x PBS + 0,6% glucosio + 2% penicillina-streptomicina) e conservare in frigorifero.
2. Preparare 100 ml di terreno senza siero (SFM) e scaldare a 37 °C. Per preparare la SFM, aggiungere 2 mM di L-glutammina, 100 μg/ml di penicillina-streptomicina, il 2% di B27 e il 10% di miscela ormonale al terreno Neurob....

Risultati

Figura 1. Laminectomia del midollo spinale di ratto e dissezione della regione periventricolare. (A) All'estremità caudale esposta del midollo spinale, i rongeurs vengono inseriti extraduralmente nella faccia laterale del canale spinale. (B) Piccoli tagli vengono praticati nella lamina su ciascun lato delle vertebre e la lamina viene accuratamente staccata per esporr.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x PBS	Tecnologie per la vita	#10010023	Tampone di dissezione
1x scheda HBSS	Tecnologie per la vita	#14175095	Tampone di dissezione
D-glucosio	sigma	# G-6152	Preparare una soluzione madre di glucosio al 30% per il tampone di dissezione e la miscela ormonale
Penicillina-Streptomicina	Tecnologie per la vita	#15140-148	Tampone di dissezione e terreno di coltura
Neurobasale-A	Tecnologie per la vita	#10888-022	Terreno di coltura
L-glutammina, 200 mM	Tecnologie per la vita	#25030-081	Terreno di coltura
B27	Tecnologie per la vita	#12587010	Terreno di coltura
DMEM	Tecnologie per la vita	#11885084	Mix ormonale
F12	Tecnologie per la vita	#21700-075	Mix ormonale
NaHCO3	sigma	# S-5761	Preparare la soluzione madre di NaHCO3 al 7,5% per la miscela ormonale
HEPES	sigma	#H9136	Preparare la soluzione madre 1M HEPES per la miscela ormonale
insulina	sigma	#I-5500	Mix ormonale
Apo-transferrina	sigma	#T-2252	Mix ormonale
putrescina	sigma	# P7505	Mix ormonale
selenio	sigma	#S-9133	Mix ormonale
progesterone	sigma	#P-6149	Mix ormonale
EGF, mouse	sigma	#E4127	Preparare 100 μg/ml di stock in B27 e aliquota; EFH medio
bFGF, ricombinante umano	sigma	#F0291	Preparare 100 μg/ml di stock in B27 e aliquota; EFH medio
Eparina, 10.000 U	sigma	#H3149	Preparare 27,3 mg/ml di brodi in miscela ormonale e aliquota; EFH medio
Kit per dissociazione della papaina	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contiene EBSS, papaina, DNasi, inibitore della proteasi ovomucoide con BSA
Pentobarbital di sodio	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Pinze per tessuti: Addisons	Strumenti per la scienza	#11006-12	Punta standard seghettata; disponibile anche micro-punta
Pinze fini: Dumont #4	Strumenti per la scienza	#11241-30
Microforbici	Strumenti per la scienza	#15024-10	Vannas a manico tondo
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
Piastre di Petri da 10 mm	Nunc	Anno 1501
Palloni di coltura T25	Nunc	156367
Piastre a 6 pozzetti	Nunc	CA73520-906