Isolamento e coltura di periciti cerebrali di topo

Abstract

Fonte: Mehra, A., et al., Un metodo ad alto rendimento per isolare i periciti cerebrali dal topo. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra un metodo per isolare i periciti cerebrali dal cervello di un topo. Le cellule isolate vengono coltivate in terreni specifici per i periciti per promuovere la proliferazione dei periciti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare 500 mL di tampone di lavaggio A (WBA): 10 mM di soluzione HEPES nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). Conservare a 4 °C.
2. Preparare 500 mL di tampone di lavaggio B (WBB): 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) con 10 mM di soluzione HEPES in HBSS. Conservare a 4 °C.
3. Preparare 300 mL di soluzione di destrano al 30% in WBA mescolando la soluzione per una notte a temperatura ambiente. Autoclavare la soluzione in autoclave a 110 °C per 30 minuti prima dell'uso. Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare riposare la soluzione a temperatura ambiente per 2-3 ore. Conservare la soluzione a 4 °C.
4. Preparare 100 mL di soluzione di BSA allo 0,1% in soluzione fredda di destrano. Agitare energicamente per 3-4 minuti e conservare a 4 °C.
5. Preparare il terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sciogliendo il 20% di siero di vitello, 2 mM di glutammina, 50 μg/mL di gentamicina, l'1% di vitamine, il 2% di aminoacidi Basal Medium Eagle (BME) in terreno di DMEM basale e conservare a 4 °C. Aggiungere 1 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) prima dell'uso.
6. Preparare un terreno pericitario completo aggiungendo integratori per la crescita dei periciti (forniti con il terreno pericitario) e il 20% di siero fetale di vitello (FCS) in terreno basale di coltura pericitaria e conservare a 4 °C.

2. Recupero del tessuto cerebrale e rimozione delle meningi

1. Per coerenza, usa topi di età simile e dello stesso sesso in ogni lotto di estrazione. Utilizzare un rifugio per animali privo di agenti patogeni e fornire un accesso ad libitum all'acqua. Per garantire l'efficienza e l'uso minimo di animali, evitare la perdita di materiale tissutale.
2. Eutanasia C57BL/6J, 4-6 settimane, topi maschi (Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, Francia).
3. Asportare rapidamente il tessuto cerebrale in condizioni sterili, evitare qualsiasi danno al tessuto. Posizionare con cura il tessuto in 40 mL di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS).
4. Trasferire il tessuto cerebrale in PBS freddo in una capsula di Petri (100 mm x 15 mm).
5. Posizionare il tessuto cerebrale su una salvietta sterile, asciutta e priva di lanugine e con una pinza a punta curva, rimuovere il cervelletto, lo striato e i nervi occipitale.
   1. Rimuovere tutte le meningi visibili con un batuffolo di cotone. Posizionare il tessuto cerebrale a testa in giù e aprire i lobi con un batuffolo di cotone con movimenti leggeri verso l'esterno. Rimuovere tutti i vasi sanguigni visibili.
   2. Mettere il tessuto cerebrale libero dalle meningi in una capsula di Petri (100 mm x 15 mm) con 15 mL di WBB freddo.

3. Omogeneizzazione

1. Trasferire il tessuto in una provetta di mortaio per macina tessuti Dounce e aggiungere 3-4 ml di WBB con una pinza.
2. Tritare il fazzoletto con un pestello "sciolto" 55 volte. Sciacquare il pestello "sciolto" con WBB. Ora tritate l'impasto con un pestello "stretto" 25 volte.
3. Dividere equamente l'impasto in due provette da 50 ml e aggiungere 1,5 volte il volume di BSA-destrano freddo al 30%, agitando energicamente le provette per mescolare l'impasto.

4. Isolamento della frazione vascolare

1. Dopo aver agitato energicamente le provette, centrifugare le provette per 25 minuti a 3.000 x g e 4 °C.
2. Trasferire il surnatante (insieme allo strato superiore di mielina) in 2 nuove provette e centrifugare le provette per 25 minuti a 3.000 x g e 4 °C. Conservare i pellet della prima centrifugazione aggiungendo 3 mL di WBB freddo (mantenere il pellet a 4 °C).
3. Ripetere il passaggio 4.2 e conservare con cura i pellet della 2a centrifugazione.
4. Eliminare il destrano e la mielina con i detriti tissutali dalle provette dal passaggio 4.3. Conservare i pellet in WBB freddo.
5. Raggruppare il contenuto della provetta 1 e della provetta 2 dal passaggio 4.1 e portare al volume finale di 10 mL con WBB freddo.
6. Ripetere questo passaggio per i tubi dal passaggio 4.2 e dal passaggio 4.3.
   NOTA: Infine, ci sono 3 provette da 3 centrifugazioni.
7. Dissociare il pellet con 6 movimenti su e giù con una pipetta da 10 mL fino a quando non rimangono grumi visibili di pellet.
8. Filtrare le sospensioni cellulari di ciascun tubo utilizzando un gruppo filtro sottovuoto e un filtro a rete di nylon.
   nota: Questa fase di filtrazione è importante per rimuovere i recipienti più lunghi/più grandi tramite il filtro a rete.
9. Recuperare e risospendere i capillari raschiando il filtro con l'aiuto di una pinza a punta piatta o di un raschietto in WBB a temperatura ambiente. Filtrare la sospensione con un filtro nuovo per recuperare più capillari
10. Dividere il filtrato in parti uguali in due provette e centrifugare per 7 minuti a 1.000 x g e RT.
    NOTA: Durante questa fase di centrifugazione, preparare la soluzione enzimatica. Determinare il volume di WBB necessario in base al numero di animali utilizzati (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 1 volta di DNasi 1 e 1 volta di tosil-L-lisil-cloridrato di cloridrato (TLCK) (vedi Tabella dei materiali) in WBB e preriscaldare a 37 °C.
11. Raccogliere i pellet del passaggio 4.10 in una provetta con WBB preriscaldato con enzimi. Aggiungere 1x collagenasi/dispasi preriscaldata. Immergere il tubo nel bagno d'acqua della tavola vibrante a 37 °C per 33 minuti esatti.
12. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 30 ml di WBB freddo. Centrifugare la sospensione per 7 minuti a 1.000 x g e RT.
13. Eliminare con cautela il surnatante e dissociare il pellet nel WBB con 6 movimenti su e giù utilizzando una pipetta da 10 ml. Questo passaggio dovrebbe essere meno rigoroso e relativamente più veloce.
14. Centrifugare la sospensione per 7 minuti a 1.000 x g e RT.
    NOTA: Durante questa fase, scartare il rivestimento dalle piastre di coltura e sciacquarle una volta con DMEM a temperatura ambiente. Rivestire le piastre di coltura cellulare per almeno 1 ora a RT.
15. Scartare il surnatante dalla provetta ottenuta al passaggio 4.14 e dissociare il pellet in un nuovo terreno DMEM completo, piastrare le cellule (Giorno 0, P0) in 9 pozzetti di piastre a 6 pozzetti (1 pozzetto da 9,6 cm2 ciascuno).

5. Proliferazione dei periciti cerebrali

1. Mantenere le colture cellulari a 37 °C e al 5% di CO₂ in un incubatore sterile. Sostituire i terreni di coltura dopo 24 ore (giorno 1) di piastratura delle cellule rimuovendo con cura i detriti. Dopo il giorno 1, cambiare i terreni di coltura ogni 48 ore.
2. Osservare la coltura cellulare per almeno 7-8 giorni. A questo punto, le crescite cellulari sulla parte superiore dell'unistrato endoteliale dovrebbero essere osservabili.
3. Passaggio delle cellule il giorno 8-10 (a seconda della confluenza) nel terreno di coltura pericitaria al passaggio 1 (P1) su piastre di coltura rivestite di gelatina. Cambia i terreni di coltura ogni 2 giorni. Osservare le cellule per 6-7 giorni. Le cellule vengono nuovamente divise consecutivamente al passaggio 2 (P2) il giorno 17 [e al passaggio 3 (P3) il giorno 24 solo se necessario], coltivate in terreno pericitario in piastre rivestite di gelatina.
   nota: Le cellule devono essere pronte per gli esperimenti/l'osservazione con una confluenza di quasi l'80-90%.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Aminoacidi BME	sigma	B-6766	Conservare a 4 °C.
Terreni DMEM basali	Invitrogen	316000083	Conservare a 4 °C.
Fattore di crescita di base dei fibroblasti	sigma	F-0291	Conservare a -20 °C.
Bsa	sigma	A-8412	Conservare a 4 °C.
Collagenasi dispasi	sigma	10269638001	Preparare una soluzione madre 10x in PBS-CMF sterile. Filtrare la soluzione con un filtro per siringa da 0,22 μm e conservare a -20 °C. Nota: per la fase di digestione enzimatica del protocollo, per ogni set di 10 topi da estrarre, sono necessari 300 μL di 10x collagenasi dispasi.
Destrano	sigma	Telefono 31398
DNasi I	sigma	11284932001	Preparare una soluzione madre 1000X sciogliendo 100 mg in 10 ml di acqua sterile e conservare a -20°C.
gelatina	sigma	G-2500	Preparare il rivestimento di lavoro preparando una soluzione di gelatina allo 0,2% in PBS-CMF sterile (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 0,2 g/L KH2PO4, 2,86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Sterilizzare la soluzione in autoclave per almeno 20 minuti a 120 °C e conservarla a temperatura ambiente. Le piastre di coltura devono essere rivestite per almeno 4 ore a 4 °C.
Gentamicina	Biochrom AG	A-2712	Conservare a 4 °C.
glutammina	Merck	I.00289	Conservare a -20 °C.
S.b.B	sigma	H-8264	Conservare a 4 °C.
HEPES	sigma	H-0887	Conservare a 4 °C.
Matrigel	BD Biocoat	Codice 354230	Preparare una soluzione di rivestimento di lavoro di Matrigel diluendo il materiale in DMEM a freddo in rapporto 1:48 con la sua concentrazione finale di 85 μg/cm2. Le piastre per colture cellulari devono essere rivestite per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
Pericita Medio-topo	Laboratori di ricerca Sciencell	Codice: 1231	Conservare a 4 °C.
Tosil Lisina Clorometilchetone	sigma	T-7254	Preparare una soluzione madre 1000X in WBA sciogliendo 16 mg in 10,88 mL di WBA per ottenere una soluzione da 4 mM e conservare a 4 °C.
vitamine	sigma	B-6891	Conservare a -20 °C.
Strumenti di filtrazione	Sefar, Rete di nylon, porosità 60 micron
attrezzatura di laboratorio	Centrifuga a rotore a secchiello oscillante
Bagnomaria con agitatore
Cappa a flusso laminare : BSL2
Vetreria (tutti i componenti devono essere sterilizzati a caldo)	Smerigliatrice per tessuti con pestello di vetro
Pestello I: 0,0035 - 0,0065 pollici
Pestello II: 0,0010 - 0,0030 pollici
Gruppo filtro sottovuoto con base di supporto del filtro in vetro fritte a porosità grossolana