Isolamento e coltura di periciti cerebrali di topo

Abstract

Fonte: Mehra, A., et al., Un metodo ad alto rendimento per isolare i periciti cerebrali dal topo. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra un metodo per isolare i periciti cerebrali dal cervello di un topo. Le cellule isolate vengono coltivate in terreni specifici per i periciti per promuovere la proliferazione dei periciti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare 500 mL di tampone di lavaggio A (WBA): 10 mM di soluzione HEPES nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). Conservare a 4 °C.
2. Preparare 500 mL di tampone di lavaggio B (WBB): 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) con 10 mM di soluzione HEPES in HBSS. Conservare a 4 °C.
3. Preparare 300 mL di soluzione di destrano al 30% in WBA mescolando la soluzione per una notte a temperatura ambiente. Autoclavare l....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Aminoacidi BME	sigma	B-6766	Conservare a 4 °C.
Terreni DMEM basali	Invitrogen	316000083	Conservare a 4 °C.
Fattore di crescita di base dei fibroblasti	sigma	F-0291	Conservare a -20 °C.
Bsa	sigma	A-8412	Conservare a 4 °C.
Collagenasi dispasi	sigma	10269638001	Preparare una soluzione madre 10x in PBS-CMF sterile. Filtrare la soluzione con un filtro per siringa da 0,22 μm e conservare a -20 °C. Nota: per la fase di digestione enzimatica del protocollo, per ogni set di 10 topi da estrarre, sono necessari 300 μL di 10x collagenasi dispasi.
Destrano	sigma	Telefono 31398
DNasi I	sigma	11284932001	Preparare una soluzione madre 1000X sciogliendo 100 mg in 10 ml di acqua sterile e conservare a -20°C.
gelatina	sigma	G-2500	Preparare il rivestimento di lavoro preparando una soluzione di gelatina allo 0,2% in PBS-CMF sterile (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 0,2 g/L KH2PO4, 2,86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Sterilizzare la soluzione in autoclave per almeno 20 minuti a 120 °C e conservarla a temperatura ambiente. Le piastre di coltura devono essere rivestite per almeno 4 ore a 4 °C.
Gentamicina	Biochrom AG	A-2712	Conservare a 4 °C.
glutammina	Merck	I.00289	Conservare a -20 °C.
S.b.B	sigma	H-8264	Conservare a 4 °C.
HEPES	sigma	H-0887	Conservare a 4 °C.
Matrigel	BD Biocoat	Codice 354230	Preparare una soluzione di rivestimento di lavoro di Matrigel diluendo il materiale in DMEM a freddo in rapporto 1:48 con la sua concentrazione finale di 85 μg/cm2. Le piastre per colture cellulari devono essere rivestite per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
Pericita Medio-topo	Laboratori di ricerca Sciencell	Codice: 1231	Conservare a 4 °C.
Tosil Lisina Clorometilchetone	sigma	T-7254	Preparare una soluzione madre 1000X in WBA sciogliendo 16 mg in 10,88 mL di WBA per ottenere una soluzione da 4 mM e conservare a 4 °C.
vitamine	sigma	B-6891	Conservare a -20 °C.
Strumenti di filtrazione	Sefar, Rete di nylon, porosità 60 micron
attrezzatura di laboratorio	Centrifuga a rotore a secchiello oscillante
Bagnomaria con agitatore
Cappa a flusso laminare : BSL2
Vetreria (tutti i componenti devono essere sterilizzati a caldo)	Smerigliatrice per tessuti con pestello di vetro
Pestello I: 0,0035 - 0,0065 pollici
Pestello II: 0,0010 - 0,0030 pollici
Gruppo filtro sottovuoto con base di supporto del filtro in vetro fritte a porosità grossolana

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