$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparare la miscela enzimatica 1 e 2 per ogni campione
NOTA: Per volumi superiori a 2 mL, utilizzare una pipetta sierologica da 10 mL; per volumi, 200 μL-2 mL, utilizzare una pipetta da 1000 μL; per volumi, 21-199 μL, utilizzare una pipetta da 200 μL; per volumi, 2-20 μl, utilizzare una pipetta da 20 μl; per volumi inferiori a 2 μl, utilizzare una pipetta da 0-2 μl.
- Per ogni campione, scongelare un'aliquota dell'enzima P e dell'enzima A a temperatura ambiente.
- Per la miscela enzimatica 1, combinare 50 μl di enzima P e 1900 μl di tampone Z in una provetta C marcata (Table of Materials).
- Per la miscela enzimatica 2, aggiungere 20 μL di tampone Y all'aliquota di 10 μL scongelata di enzima A.
2. Protocollo di dissociazione cerebrale adulta
NOTA: Quando si lavora con i campioni, le provette devono essere collocate in un rack per provette a temperatura ambiente mentre BSA e D-PBS rimangono sul ghiaccio, se non diversamente specificato.
- Accendere il dissociatore.
- Usa una pinza per trasferire i pezzi di tessuto dell'ippocampo nel tubo C.
- Trasferire 30 μl di miscela enzimatica 2 nella provetta C. Ruotare il tappo finché non si avverte tensione, quindi serrare finché non scatta.
- Posizionare il tubo C capovolto in una posizione del dissociatore; al campione verrà assegnato lo stato Selezionato (Figura 1). Fissare il riscaldatore sopra il tubo C.
- Premere l'icona della cartella, selezionare la cartella Preferiti, scorrere e selezionare il programma 37C_ABDK_02. Fare clic su OK per applicare il programma a tutte le valvole C selezionate, quindi toccare Start (Figura 1).
- Etichettare una provetta conica da 50 mL per campione.
- Posizionare un colino cellulare da 70 μm su ciascuna provetta conica da 50 mL e bagnare con 2 mL di tampone BSA.
- Al termine del programma, rimuovere il riscaldatore e il tubo C dal dissociatore.
- Aggiungere 4 mL di tampone BSA al campione e applicare la miscela al filtro cellulare sulla provetta conica da 50 mL.
- Aggiungere 10 mL di D-PBS alla provetta C, chiuderla e agitare delicatamente la soluzione. Applicarlo sul colino cellulare sulla provetta conica da 50 mL.
- Eliminare il filtro cellulare e la provetta C. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 minuti a 4°C. Quindi, aspirare e scartare il surnatante.
3. Rimozione dei detriti
- Risospendere il pellet con 1550 μL di D-PBS freddo e trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 mL etichettata.
- Aggiungere 450 μl di soluzione fredda per la rimozione dei detriti e pipettare su e giù (senza vortici).
NOTA: La soluzione per la rimozione dei detriti è un reagente nel kit di dissociazione Brian per adulti in commercio.
- Sovrapporre delicatamente 1 mL di D-PBS freddo sopra la sospensione cellulare, mantenendo la punta contro la parete del tubo conico. Ripetere fino a quando la sovrapposizione totale è di 2 ml.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale; Esegui con competenza e destrezza.
- Centrifugare a 3000 x g per 10 minuti a 4°C con accelerazione e freno a volontà.
NOTA: Se le fasi non sono chiaramente separate, ripetere i passaggi 7.2-7.3. Centrifugare un'ultima volta a 1000 x g per 10 minuti a 4°C.
- La sospensione dovrebbe ora consistere di tre strati distinti (Figura 2). Aspirare lo strato più in alto. Passare la punta della pipetta avanti e indietro per aspirare lo strato intermedio bianco. Rimuovere il più possibile lo strato intermedio senza disturbare lo strato più in basso.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale; Esegui con competenza e destrezza.
- Aggiungere 2 mL di D-PBS freddo e pipettare su e giù per mescolare.
- Centrifugare a 1000 x g per 10 minuti a 4°C con accelerazione e freno completi. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone BSA.
NOTA: Le cellule possono essere risospese nel buffer appropriato, quindi etichettate magneticamente e isolate in preparazione per il sequenziamento di singole cellule a questo punto.
