Preparazione di una sospensione unicellulare di cellule immunitarie da tessuto cerebrale murino

Abstract

Fonte: DiSano, K. D., et al. Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie. J. Vis. Exp. (2020).

Il video dimostra la preparazione di una sospensione unicellulare di cellule immunitarie da un tessuto cerebrale murino. Prevede la digestione enzimatica per rilasciare le cellule dal tessuto cerebrale, seguita dalla centrifugazione in gradiente di densità per isolare le cellule immunitarie in base alla loro densità per ottenere la sospensione di una singola cellula.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione di sospensioni unicellulari di tessuto cerebrale e del midollo spinale

1. Trasferire il tessuto cerebrale o del midollo spinale con il terreno sulla parte superiore della piastra di Petri da 100 mm versando il tessuto e il terreno dal tubo. Usando una pinza, sposta il tessuto sul fondo della capsula di Petri. Tritare finemente il cervello o il midollo spinale con una lama di rasoio sterile. Usando la lama del rasoio, sposta il tessuto tritato sul fondo della piastra raschiando per raccogliere il tessuto.
   nota: Per il protocollo di digestione enzimatica riportato di seguito, è possibile raggruppare fino a due midoni spinali per l'elaborazione. I cervelli dovrebbero essere elaborati individualmente.
2. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, aggiungere 3 mL di RPMI (terreno del Roswell Park Memorial Institute (integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) alla capsula di Petri. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, pipettare su e giù per risospendere il tessuto nel terreno e trasferirlo in una provetta conica da 15 mL.
   nota: Se l'applicazione a valle è l'analisi del sequenziamento dell'RNA su una singola cellula o in massa o la coltura cellulare, i lotti FCS devono essere testati per garantire che le cellule non vengano attivate prima dell'analisi. In alternativa, le cellule possono essere elaborate utilizzando 1x PBS con 0,04% BSA invece di RPMI con 10% FCS.
3. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, lavare la piastra di Petri con altri 2 mL di terreno per raccogliere il tessuto residuo e trasferirla in una provetta conica per un volume totale di 5 mL. Mantenere i tubi sul ghiaccio tra le fasi di lavorazione.
4. Utilizzando una pipetta, risospendere la polvere di collagenasi I nel terreno HBSS (Balanced Salt Solution) di Hank per ottenere la concentrazione desiderata (ad es. 100 mg/mL). Aggiungere la collagenasi di tipo I alla provetta conica contenente il campione di tessuto tritato per ottenere la concentrazione finale desiderata (ad esempio, 50 μL per 1 mg/mL).
   nota: Concentrazioni più elevate di collagenasi aumenteranno la resa cellulare, ma possono scindere i marcatori della superficie cellulare. Pertanto, i lotti di collagenasi I devono essere titolati per determinare la concentrazione ottimale necessaria per ottenere il maggior numero di cellule vitali con tutti i marcatori di superficie cellulare richiesti intatti. Ad esempio, la collagenasi I è stata testata a concentrazioni finali di 0,5 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL su singoli campioni di cervello o midollo spinale. La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano e i marcatori di superficie cellulare CD45, CD19 e CD4 sono stati valutati mediante citometria a flusso. Una concentrazione di 1 mg/mL di collagenasi I ha prodotto la più alta conta di cellule vive pur mantenendo tutti i marcatori di superficie cellulare di interesse. Pertanto, questa concentrazione è stata utilizzata per ulteriori esperimenti che esaminano questi tipi di cellule.
5. Risospendere delicatamente la polvere di DNasi I utilizzando 0,15 M di cloruro di sodio alla concentrazione madre desiderata. Aggiungere la DNasi I risospesa alla provetta conica contenente il campione di tessuto tritato per ottenere una concentrazione finale di 20 U/mL.
   nota: I lotti di DNasi I variano in base alle unità di attività per ml. La concentrazione da aggiungere al campione di tessuto cambierà in base alle unità di attività per millilitro della fiala di riserva. La concentrazione finale desiderata per campione è di 20 U/mL.
6. Posizionare le provette in un rack per provette a bagnomaria a 37 °C e incubare per 40 minuti. Capovolgere le provette ogni 15 minuti per miscelare accuratamente il tessuto con gli enzimi. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 μL di EDTA 0,1 M (pH = 7,2) a ciascuna provetta per una concentrazione finale di 0,01 M EDTA e incubare per altri 5 minuti per inattivare la collagenasi.
7. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 9 mL di RPMI integrato con FCS al 10% a ciascuna provetta per portare il volume di ciascuna provetta a ~14,5 mL. Centrifugare a 450 x g per 5 min a 4 °C. Utilizzando una pipetta Pasteur con vuoto, aspirare il surnatante, facendo attenzione a non toccare il pellet cellulare.
8. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, aggiungere 3 mL di soluzione stock a gradiente di densità isotonica al 100% nella provetta contenente il pellet cellulare. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere ulteriori terreni RPMI 10% FCS per portare il volume finale a 10 mL e risospendere il pellet cellulare per creare uno strato di soluzione a gradiente di densità isotonica stock al 30%.
   nota: Preparare in anticipo il terreno di gradiente di densità isotonica 100% stock, aliquotare e conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Per preparare la soluzione stock di gradiente di densità isotonica al 100%, diluire il mezzo di gradiente di densità (Tabella dei materiali) con un tampone di diluizione del mezzo di gradiente di densità. Preparare il tampone di diluizione del terreno a gradiente di densità (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na₂HPO₄, 0,20 g/L KH₂PO₄; 20,0 g/L glucosio) e sterilizzare con il filtro utilizzando un sistema di filtraggio sottovuoto. Preparare la soluzione stock di gradiente di densità isotonica al 100% mescolando 1 parte del tampone di diluizione del gradiente di densità e 9 parti del mezzo di gradiente di densità. Mescola bene.
9. Capovolgere e mescolare bene ogni provetta prima di aggiungere il sottofondo della soluzione a gradiente di densità isotonica al 70%. Inserire una pipetta sierologica da 1 mL contenente 1 mL di soluzione stock a gradiente di densità isotonica al 70% sul fondo della provetta. Stendere lentamente 1 mL di soluzione, facendo attenzione a non formare bolle. Rimuovere lentamente la pipetta sierologica dal tubo, facendo attenzione a non disturbare il gradiente.
   nota: Per il sottofondo al 70%, la soluzione stock al 100% di gradiente di densità isotonica deve essere diluita al 70% utilizzando terreni RPMI (ad esempio, 7 mL di soluzione stock di gradiente di densità isotonica al 100% e 3 mL di terreno RPMI ben miscelati). Inoltre, la creazione di un sottofondo pulito e indisturbato al 70% è essenziale per la rimozione dei detriti di mielina e per ottenere sospensioni unicellulari pure all'interfaccia del gradiente dopo la centrifugazione.
10. Centrifugare a 800 x g per 30 min a 4 °C senza freno. Aspirare il surnatante, compreso lo strato di detriti di mielina fino a quando rimangono 2-3 mL nella provetta, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Raccogliere lo strato cellulare tra il gradiente di densità del 30/70% utilizzando una pipetta da 1 ml e trasferirlo in una nuova provetta conica da 15 ml.
11. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere il terreno RPMI 10% FCS per portare il volume finale a 15 mL. Centrifugare 450 x g per 5 min a 4 °C.
    nota: Durante questa fase, se necessario, è possibile raggruppare gli strati cellulari di due provette. Non accumulare più di due provette, altrimenti le celle non si pellettizzeranno a causa di una concentrazione di mezzi a gradiente ad alta densità.
12. Aspirare attentamente il surnatante per non disturbare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in un volume/tampone appropriato per contare le cellule utilizzando un emocitometro (ad esempio, risospendere un singolo midollo spinale in 250 μL di tampone FACS per la colorazione superficiale a valle) (Figura 1).
13. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire le sospensioni cellulari nella parte superiore di una provetta filtrante (Tabella dei materiali) e lasciare che le cellule filtrino sul fondo della provetta per rimuovere eventuali residui di mielina.
14. Usando il colorante di esclusione blu di tripano, diluirlo e contare le cellule su un emocitometro calcolando la media di almeno due griglie quadrate di almeno due 16 quadrati per una precisione40,41.
15. Procedere con la tecnica di analisi a singola cellula desiderata.
    nota: Utilizzando varie forme di collagenasi (ad esempio, D, tipo I, tipo II, tipo IV), le cellule immunitarie, la microglia (Figura 1), gli astrociti, i periciti, le cellule endoteliali49 e i neuroni50 possono essere isolati in modo efficiente. La conta delle cellule nucleate ottenute per i risultati è stata la seguente utilizzando l'enzima collagenasi I titolato: Intero cervello trattato con sham = 500.000-600.000 cellule; Intero cervello TMEV-IDD = 800.000-1.000.000 di cellule; Midollo spinale intero trattato con sham = 150.000-200.000 cellule; Intero midollo spinale TMEV-IDD = 300.000-400.000. La conta delle cellule varia a seconda della precisione della raccolta, dell'elaborazione e della presenza di infiammazione del SNC.

Risultati

Figura 1: Identificazione delle cellule immunitarie infiltranti CD45hi nei tessuti del SNC. (A) Strategia di gating per l'identificazione di cellule immunitarie infiltranti CD45hi (P1), microglia CD45lo (P2) e oligodendrociti, astrociti e neuroni CD45-tra cellule vive totali nel midollo spinale di topi trattati con sham (rosso) o TMEV-IDD (blu). Cellule CD45hi minime sono state rilevate nel cervel...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina	ThermoFisher Scientifico	37002D
centrifuga	Beckman Coulter	Centrifuga Allegra X-12R
Collagenasi I	Worthington	LS004196
Provetta conica, 15 mL	VWR	525-1069
Provetta conica, 50 mL	VWR	Codice 89039-658
Vetro di copertura	Hauser Scientific	5000
Pinze curve	Strumenti per la scienza	Codice 11003-14
Provetta monouso in polistirene, 14 mL	Fisher Scientifico	14-959-1B
DNasi I	Worthington	LS002139
Ghiaccio secco	Aria gas	N/A
Durmont #7Forceps	Strumenti per la scienza	Codice 11271-30
EDTA sale disodico diidrato	Amresco	0105-500g
Etanolo, 100%	qualunque	N/A
Tubo orizzontale filtrante, 5 mL	VWR	352235
Colorazione di vitalità fissabile 780	Becton Dickinson	565388
glucosio	Fisher Chemical	D16-500
Soluzione salina balncata di Hank (HBSS)	Corning	21-020-CV
Emocitometro	Andwin Scientific	02-671-51B
Emostatico	Strumenti per la scienza	Codice: 13004-14
HEPES (acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico)	ThermoFisher Scientifico	15630080
Kcl	Fisher chimico	BP366-500
KH2PO4 (anidro)	Sigma Aldrich	P5655-100G
azoto liquido	Aria gas	N/A
Blocco FC del mouse (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (anidro)	Fisher Chemical	S374-500
NaCl	Fisher chimico	S671-500
Ago, calibro 25	Becton Dickinson	305122
Siero di topo normale	ThermoFisher Scientifico	Codice: 31881
Filtro in rete di nylon	VWR	Codice 352350
OTTOBRE	Sakura	4583
Paraformaldeide, 20%	Scienze della microscopia elettronica	15713-S	Diluito al 4% con 1 x PBS
Pipetta Pasteur, 9 pollici, unplugged	Fisher Scientifico	13-678-20C
PBS (1x)	Corning	21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4	Becton Dickinson	Codice: 553730
PE-CF594 Ratto Anti-Topo CD19	Becton Dickinson	562329
Mezzi di gradiente di densità Percoll	GE sanità	Codice 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Ratto Anti-Topo CD45	Becton Dickinson	550994
Piastra di Petri, 100 mm	VWR	353003
Misuratore di pH	Fisher Scientifico	13-636-AB150
Pipet-Aid	Società scientifica Drummond	4-000-101
Pipetta 200 μl	Gilson	FA10005M
Puntali per pipette, 1 mL	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1111-2831
Puntali per pipette, 200 μl	Stati Uniti d'America Scientific	Codice: 1111-1816
Pipetta, 1 mL	Gilson	FA10006M
Montante Diamond Prolong con DAPI	ThermoFisher Scientifico	P36962
Ratto Purificato Anti-Topo CD16/CD32	Becton Dickinson	553141
Coniglio anti-topo CD3 (clone SP7)	Abcam	ab16669
Coniglio anti-topo laminina	Abcam	ab11575
Anti-topo per ratti ERT-R7	Abcam	ab51824
RPMI 1640	Corning	10-040-CV
Pipetta sierologica, 1 mL	VWR	357521
Pipetta sierologica, 10 mL	VWR	357551
Pipetta sierologica, 5 mL	VWR	357543
idrossido di sodio	Fisher Scientifico	S318-100
saccarosio	Fisher chimico	S5-500
Forbici chirurgiche	Strumenti per la scienza	Codice: 14001-16
Forbici chirurgiche, extra fini	Roboz	RS-5882
Siringa, 10 mL	Becton Dickinson	302995
Siringa, 5 mL	Becton Dickinson	309646
Tripan blu	Gibco	Codice 15250-061