Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione della lampada a luce soffusa (giorno 1)
- Utilizzare una lavagna acrilica trasparente con uno spessore di 0,3-0,5 cm nel formato di un foglio A5. Incolla i tamponi bianchi sulla parte anteriore e posteriore della lastra acrilica.
- Installare una fila di luci bianche a LED sul bordo della piastra in modo che le luci possano entrare dal lato della lastra acrilica e quindi sparare in parallelo (Figura 1A-F, Figura 2B).
nota: Poiché i diametri degli EB nella fase iniziale sono compresi tra 200 μm e 300 μm, è difficile osservarli chiaramente ad occhio nudo sotto la lampada fluorescente dei banchi puliti. Al contrario, grazie al miglioramento della riflessione diffusa, possiamo rilevare chiaramente gli EB utilizzando una luce morbida illuminata lateralmente (Figura 2B, C). Una piastra a 6 pozzetti è consigliata per le colture EB negli esperimenti successivi. Tuttavia, per mostrare meglio l'effetto visivo della luce soffusa, i piatti vengono talvolta utilizzati per scattare foto e video in questo studio al posto dei piatti, quindi per favore non fraintendete. La lampada a luce soffusa illuminata lateralmente può essere utilizzata anche per la piastra a 6 pozzetti.
2. Trasferimento EB e sostituzione del mezzo (giorni 2-5)
- Preparare una nuova piastra a 6 pozzetti a bassa adesione e aggiungere 2 mL di terreno di formazione del corpo embrioide (EB) a ciascun pozzetto.
- Rimuovere gli EB insieme al terreno con un puntale per pipetta a foro largo da 1000 μl (vedere la Tabella dei materiali) e trasferirli sulla piastra a 6 pozzetti a bassa adesione (~100 EB/pozzetto).
nota: Il processo operativo adotta una lampada a luce soffusa (menzionata nel passaggio 1) per rendere gli EB più facili da osservare. Spegnere le altre fonti di luce interna per migliorare l'effetto visivo della luce soffusa.
- Sostituire con lo stesso volume di terreno fresco per la formazione di EB ogni giorno. Usa il flusso secondario per raccogliere gli EB al centro e cambiare il mezzo.
- Aspirare lentamente il vecchio terreno pipettandolo fino al bordo del pozzetto. Non succhiare troppo forte; in caso contrario, gli EB verranno rimossi insieme. Quindi, aggiungere un terreno fresco per risospendere gli EBs.
nota: Il flusso secondario principale (Figura 2D). Indurre un flusso vorticoso ruotando la parabola lungo un'orbita circolare. A causa del flusso a vortice, viene indotto un flusso secondario e diretto verso il centro. Gli EB o organoidi convergono verso il centro del pozzetto a causa del flusso secondario generato attraverso la rotazione, dopodiché il cambiamento del mezzo o il trasferimento dell'embrioide possono essere eseguiti prontamente.
3. Induzione neurale (giorni 5-7)
- Preparare una nuova piastra a 6 pozzetti a bassa adesione e aggiungere 3 mL di terreno di induzione neurale (Tabella 1) a ciascun pozzetto.
- Accendere la luce soffusa laterale (menzionata al punto 1) e spegnere le altre fonti di luce interna.
- Trasferire gli EB sulla piastra a 6 pozzetti con l'aggiunta di un mezzo di induzione neurale (~100 EB/pozzetto). Aggiungi il meno possibile del terreno originale al nuovo pozzo.
nota: Introdurre semplici abilità di trasferimento di organoidi. Naturalmente, per gravità e con una densità relativamente più alta del mezzo, gli EB risospesi si affloseranno gradualmente applicando l'operazione mostrata in Figura 2E. In questo modo, gli EB possono essere trasferiti comodamente. Poiché, rispetto agli EB, le cellule libere e i frammenti di cellule morte affondano più lentamente, la maggior parte delle cellule libere e dei frammenti di cellule morte possono essere rimossi attraverso questo metodo di sedimentazione (Figura 2F).
- Incubare i campioni a 37 °C e 5% di CO2 per 24 h.
nota: Al microscopio, il diametro degli EB era di circa 500 μm e il bordo era traslucido, indicando che si era formato uno strato neuroepiteliale.
Tabella 1. Composizione del mezzo di induzione neurale
| Componenti | volume |
| DMEM-F12 | 97 ml |
| Integratore N2 | 1 ml |
| Integratore di glutamax | 1 ml |
| MEM-NEAA | 1 ml |
| eparina | Concentrazione finale 1 μg/mL |
