1. Terreni di coltura e preparazione degli strumenti
- Spruzzare il banco e l'area di lavoro con etanolo al 70% e lasciare asciugare.
- Spruzzare gli strumenti di dissezione, le pinze e due piatti di vetro dell'orologio, con il 70% di etanolo e lasciarli asciugare sul banco.
- Preparare il terreno di Schneider integrato (SSM, Tabella 1) e metterlo sul ghiaccio.
- Pipettare 1 mL di SSM in ciascuno dei piatti di vetro.
- Utilizzando una micropipetta con punta sterile, trasferire le larve appena schiuse dalla piastra di PBS all'SSM nel primo piatto di vetro dell'orologio. Utilizzando una micropipetta con punta sterile, trasferire le larve appena schiuse nell'SSM nel secondo piatto di vetro.
2. Dissezioni e colture cerebrali
- Una volta che le larve sono nel secondo piatto di vetro con SSM, sezionare il cervello dalle larve usando una pinza e un microscopio da dissezione. Regolare l'ingrandimento secondo necessità.
- Usa una pinza per afferrare i ganci della bocca e con l'altra, afferra delicatamente il corpo a metà e tira nella direzione opposta (Figura 1) per dividere la larva in due pezzi.
nota: Il cervello si troverà proprio dietro i ganci della bocca. Si noti che potrebbero esserci altri tessuti che circondano il cervello. Fai molta attenzione quando rimuovi questi tessuti in quanto può danneggiare il cervello.
- Una volta sezionati 15-20 cervelli, aggiungere 1 mL di SSM in un pozzetto di un vassoio di coltura sterile da 12 pozzetti. Trasferire i cervelli appena sezionati nell'SSM utilizzando una micropipetta e una punta sterile (Figura 2A).
- Collocare i cervelli nel terreno SSM nel vassoio di coltura a 12 pozzetti in un incubatore a 25 °C per 24 ore (Figura 2A).
Tabella 1: Ricetta per realizzare i media di Schneider integrati (SSM). La tabella elenca il volume di tutti gli ingredienti necessari per preparare 5 ml di SSM.
| Ingrediente (concentrazione iniziale) | Per fare 5 ml | Concentrazione finale |
| Media sulla Drosophila di Schneider | 3,89 ml | |
| Siero fetale bovino (100%) | 500 μl< | 10% |
| Glutammina (200 mM) | 500 μl | 20 mM |
| Penicillina (5000 unità/mL), Streptomicina (50.000 μg/mL) | 100 μl | 1000 U/mL Pen, 1 mg/mL Streptococco |
| Insulina (10 mg/mL) | 10 μl | 0,02 mg/mL |
| glutatione (50 mg/mL) | 5 μl | 0,05 mg/mL |
| In una cappa sterile, utilizzando la tecnica sterile, aggiungi tutti gli ingredienti insieme in una provetta conica da 14 ml. Mettilo sul ghiaccio fino al momento dell'uso. |
