Isolamento di oligodendrociti primari murini mediante microsfere immunomagnetiche

Abstract

Fonte: Flores-Obando, R. E. et al., Isolamento immunomagnetico rapido e specifico di oligodendrociti primari di topo. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule primarie degli oligodendrociti da una sospensione di cellule neurali ottenuta da un cucciolo di topo utilizzando la separazione magnetica. La tecnica impiega biglie magnetiche rivestite con anticorpi specifici per gli antigeni degli oligodendrociti, consentendo l'isolamento selettivo di queste cellule.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Dissociazione della corteccia cerebrale del topo

1. Sacrificare cuccioli di topo C57Bl/6N postnatale di 5-7 giorni mediante decapitazione rapida con forbici precedentemente pulite in etanolo al 70%.
   nota: Per ogni preparazione sono state utilizzate cortecce cerebrali di 5-6 cuccioli di topo neonatale. In media, un cervello di topo produce 1-1,5 x 10⁶ oligodendrociti primari (Ols).
2. Tagliare la pelle del cuoio capelluto lungo la linea mediana con piccole forbici da dissezione e ritrarre per esporre il cranio.
3. Taglia con cura il cranio lungo la linea mediana partendo dall'apertura nella parte posteriore del cranio verso la zona frontale, sollevando con le forbici per evitare di danneggiare il cervello. Quindi, usando l'apertura nella parte posteriore del cranio, taglia verso ciascuna orbita oculare lungo la base del cranio.
4. Usa una pinza fine per allontanare delicatamente le cortecce dal mesencefalo e trasferiscile in una piastra di coltura tissutale da 60 mm contenente 7 ml di B27NBMA. Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.4 per ogni cervello, raggruppando le cortecce sezionate.
5. Trasferire le cortecce in una nuova piastra di coltura tissutale da 60 mm contenente 5 ml di tampone di dissociazione (B27NBMA, 20-30 U/mL di papaina e 2.500 U di DNasi I).
6. Tagliare le cortecce in piccoli pezzi di circa 1 mm³ usando una lama di bisturi #15 e incubare per 20 minuti in un'incubatrice a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO₂).
7. Aggiungere 1 mL di siero per la crescita bovina (BGS) per fermare la reazione enzimatica.
8. Trasferire le cortecce insieme al terreno di dissociazione in una provetta conica da 15 ml utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml.
9. Iniziare delicatamente a dissociare il tessuto cerebrale pipettando lentamente su e giù 6-8 volte utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml, facendo attenzione a ridurre al minimo le bolle.
10. Lasciare riposare i pezzi di tessuto per 2-3 minuti e trasferire il surnatante in un tubo nuovo.
11. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente il 10% di BGS/2500 U DNasi I al pellet di tessuto.
12. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 ml per dissociare delicatamente il tessuto cerebrale durante il pipettaggio su e giù 6-8 volte. Fai attenzione a ridurre al minimo le bolle.
13. Lasciare riposare i pezzi di tessuto per 2-3 minuti.
14. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Aggiungere 3 ml di B27NBMA contenente il 10% di BGS/DNasi I al pellet tissutale.
15. Dissociare delicatamente il tessuto cerebrale utilizzando un puntale per pipetta P1000, pipettando la miscela di terreno e tessuto cerebrale su e giù. Ripetere i passaggi 2.13 e 2.14 fino a quando non rimangono più grossi pezzi di tessuto o fino a quando non si esaurisce B27NBMA contenente il 10% di BGS/DNasi I, a seconda di quale evento si verifichi per primo. Fai attenzione a ridurre al minimo le bolle.
16. Sospensione della cella della piscina con precedenti surnatanti.
17. Posizionare il filtro cellulare da 70 μm in una provetta da 50 mL. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, passare delicatamente la sospensione cellulare raggruppata sul colino cellulare da 70 μm.
18. Lavare il filtro cellulare aggiungendo 1 mL di B27NBMA contenente il 10% di BGS/DNasi I.
19. Scartare il filtro cellulare. Portare il volume a 30 ml con B27NBMA contenente il 10% di BGS/DNasi I.
20. Trasferire la sospensione cellulare in due provette coniche da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 200 x g.
21. Rimuovere il surnatante senza lasciare le celle esposte all'aria. Il surnatante sarà torbido a causa dei detriti cellulari. Aggiungere 3 ml di B27NBMA contenente il 10% di BGS al pellet.
22. Dissociare con cura il pellet cellulare utilizzando una pipetta P1000. Portare il volume a 15 mL con B27NBMA contenente il 10% di BGS.
23. Passare la sospensione cellulare su un filtro cellulare fresco da 40 μm.
24. Lavare il filtro cellulare aggiungendo 1 ml di B27NBMA contenente il 10% di BGS. Scartare il filtro cellulare.
25. Portare il volume a 30 mL con B27NBMA contenente il 10% di BGS.
26. Trasferire la sospensione cellulare in 2 provette coniche da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 200 x g.
27. Rimuovere la maggior parte del surnatante senza lasciare le celle esposte all'aria. Risospendere i pellet cellulari in 5 mL di tampone di selezione magnetica delle cellule (MCS) ghiacciato.

2. Determinazione della conta cellulare e della vitalità

1. Diluire 100 μl della sospensione cellulare con 400 μl di soluzione di tripano in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per ottenere una diluizione 1:5 allo 0,4% (p/v).
2. Centrare un vetro di copertura su una camera dell'emocitometro e riempire le due camere con 10 μl di diluizione cellulare utilizzando una pipetta P10 ed evitando un riempimento eccessivo. La soluzione passerà sotto il vetro di copertura per azione capillare.
3. Posizionare l'emocitometro sul tavolino del microscopio e regolare la messa a fuoco utilizzando l'ingrandimento 40X.
   NOTA: Il conteggio delle celle viene registrato utilizzando un contatore portatile in ciascuno dei cinque quadrati (quattro angoli e un centro). Solo le cellule non vitali assorbono il colorante e appaiono blu, mentre le cellule vive e sane appaiono rotonde e rifrangenti e non assorbono il colorante di colore blu, consentendo la determinazione del numero di cellule vitali e totali per millilitro.

3. Isolamento di oligodendrociti O4⁺

1. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 10 min.
2. Scartare con cura il surnatante utilizzando l'aspirazione a vuoto, evitando l'esposizione delle cellule all'aria.
3. Risospendere il pellet in 90 μL di tampone MCS per 1 x 10⁷ celle totali seguito dall'aggiunta di 10 μL di perle anti-O4 per 1 x 10⁷ cellule.
4. Mescolare la sospensione cellulare e le perle muovendo delicatamente la provetta conica da 15 ml con il dito 4-5 volte.
5. Incubare la miscela per 15 minuti a 4 °C, muovendo la provetta conica da 15 ml con il dito 4-5 volte ogni 5 minuti.
6. Lavare la miscela aggiungendo delicatamente 2 ml di tampone MCS per 1 x 10⁷ cellule alla provetta. Centrifugare la miscela a 200 x g per 10 min.
7. Scartare il surnatante utilizzando con attenzione l'aspirazione a vuoto, evitando l'esposizione delle cellule all'aria. Risospendere il pellet di cella in 500 μL di tampone MCS per ogni 1 x 10⁷ cellule.
8. Fissare un separatore magnetico a un supporto per separatore magnetico. Collegare una colonna di selezione al separatore magnetico e posizionare un filtro a celle da 40 μm sopra la colonna. Posizionare due provette coniche da 15 ml o una da 50 ml sotto la colonna di separazione per raccogliere il flusso.
9. Pre-sciacquare il filtro cellulare da 40 μm e la colonna di separazione con 3 mL di tampone MCS e lasciare che il tampone scorra attraverso la colonna senza lasciarla asciugare.
10. Aggiungere la miscela di sospensione cellulare e perline al filtro cellulare e nella colonna di selezione.
11. Lavare il filtro cellulare da 40 μm con 1 mL di tampone MCS.
12. Scartare il filtro cellulare e lasciare che la miscela di cellule, perle e tampone scorra attraverso la colonna senza lasciarla asciugare.
13. Lavare la colonna di separazione 3 volte con 3 mL di tampone MCS e 1 volta con terreno di proliferazione OL.
14. Rimuovere la colonna di separazione dal separatore magnetico, inserirla rapidamente in una provetta conica da 15 mL e aggiungere immediatamente 5 mL di terreno di proliferazione OL.
15. Posizionare uno stantuffo sulla parte superiore della colonna e premere con decisione per eliminare le cellule marcate nella provetta conica da 15 ml.
16. Rimuovere 100 μL di sospensione cellulare per determinare la conta e la vitalità delle cellule utilizzando il Trypan Blue e l'emocitometro come indicato nel paragrafo 3.
    NOTA: Una vitalità cellulare superiore all'80% è considerata accettabile per procedere con la coltura di OL, ma una vitalità superiore al 90% è ottimale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 ml di pipette sierologiche	Fisher Scientifico	13-676-10J
Siringa da 10 ml con punta Luer-Loc	BD, Becton Dickinson	309604
Tubi conici da 15 ml	Falcone	352097
Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti	Falcone	353935
Filtro cellulare da 40μm	Fisher Scientifico	22368547
Tubi conici da 50 ml	Falcone	352098
Pipette sierologiche da 5 ml	Fisher Scientifico	13-676-10H
Piastre per coltura tissutale da 60 mm	Falcone	353002
Filtro cellulare da 70μm	Fisher Scientifico	22363548
Perline Anti-O4- Anti-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	Codice 130-094-543
Autofil gruppo filtro completo per flaconi, filtro da 0,22 um, 250 ml	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 6032-1101
Autofil gruppo filtro completo per flaconi, filtro da 0,22 um, 250 ml	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 6032-1102
Supplemento B27	Invitrogen	Codice 17504-044
Siero per la Crescita Bovina (BGS)	GE Healthcare Scienze della vita	SH30541.03
Bsa	Fisher Scientifico	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
Desossiribonucleasi I (DNAsi I)	Worthington	LS002007
Edta	Fisher Scientifico	S311
Bisturi monouso in piuma	Andwin Scientific	EF7281C
glucosio	Fisher Scientifico	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	Codice 35050-61
insulina	Invitrogen	Codice 12585-014
Supporto separatore magnetico - MACS multistand	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-303
Separatore magnetico-Separatore MiniMACS	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-302
Unità filtro Millex PES 0,22μm	Millipore	SLG033RS
Terreno neurobasale A	Invitrogen	Codice 10888-022
papaina	Worthington	LS003126
PBS senza Ca2+ e Mg2+	sigma	D5652
Soluzione stock DNase I			1. Sciogliere a 12.500 U desossiribonucleasi I / ml in HBSS raffreddato su ghiaccio. 2. Filtro sterilizzare su ghiaccio 3. Aliquotare a 200 μl e congelare per una notte a -20°C. 4. Conservare le aliquote a una temperatura compresa tra -20 e -30°C.
salina tamponata con fosfato di Dulbecco (senza Ca2+ e Mg2+)			Sciogliere la busta in 1 litro d'acqua per ottenere 1 litro di terreno a 9,6 grammi di polvere per litro di terreno. Conservare a 2-8 °C.
Soluzione blu di Trypan	Corning	25-900-CI
B27NBMA			487,75 mL di Terreno Neurobasale A; 10 mL di Integratore B27; 1 mL di Primocin; 1,25 mL di Glutamax; Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL di siero per la crescita bovina
Soluzione madre CNTF (10 μg/ml; 1000X)			Ordina da Peprotech (450-50). Preparare da 0,1 a 1 mg/ml secondo le istruzioni del produttore (può variare da lotto a lotto) in tampone (ad es. DPBS + 0,2% BSA). Conservare a -80 °C. Soluzione di lavoro (10 μg/ml, 1000X) 1. Fare su 0,2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in soluzione DPBS e filtro sterilize. 2. Diluire l'aliquota del master stock a 10 μg/ml in BSA/DPBS. sterile refrigerato allo 0,2% 3. Aliquotare (20μl/provetta) e congelare a scatto in azoto liquido. 4. Conservare le aliquote a -80 °C.
Buffer di smistamento magnetico delle celle (MCS)			Preparare la soluzione contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2 e albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5%, EDTA 0,5 mM, insulina 5 μg/ml, glucosio 1 g/l. Sterilizzare e degassare filtrando il tampone facendolo passare attraverso un filtro Millex da 0,22 μm. Conservare il tampone a 4°C fino all'uso
Sali bilanciati di Hank (HBSS) (Sigma			1. Misurare 900 ml di acqua (temperatura 15-20 °C) in un cilindro e mescolare delicatamente. 2. Aggiungere la potenza e mescolare fino a quando non si sarà sciolto. 3. Sciacquare la confezione originale con una piccola quantità di acqua per rimuovere tutte le tracce della polvere. 4. Aggiungere alla soluzione nel passaggio 2. 5. Aggiungere 0,35 gr di bicarbonato di sodio (7,5% p/v) per ogni litro di volume finale. 6. Continuare a mescolare fino a quando non si scioglie. 7. Regolare il pH del tampone mentre si mescola a 0,1-0,3 unità al di sotto del pH = 7,4 poiché potrebbe aumentare durante la filtrazione. Si consiglia l'uso di 1N HCl o 1N NaOH per regolare il pH. 8. Aggiungere altra acqua per portare il volume finale a 1L. 9. Sterilizzare per filtrazione utilizzando una membrana con una porosità di 0,22 micron. 10. Conservare a 2-8 °C.