Preparazione di un substrato microstrutturato per studiare i fenotipi cellulari di Schwann

Abstract

Fonte: Xu, Z., Orkwis, et al. Preparazione di microambienti di matrici extracellulari sintonizzabili per valutare la specificazione del fenotipo delle cellule di Schwann. (2020).

Il video descrive la preparazione di un substrato microstrutturato per studiare la specifica del fenotipo cellulare. Un timbro PDMS microstrutturato rivestito di proteine viene utilizzato per trasferire il micropattern su un vetrino coprioggetti rivestito di PDMS. Il vetrino coprioggetti viene quindi trattato con un tensioattivo per ostacolare l'adesione delle cellule sulle superfici indesiderate. Le cellule vengono quindi aggiunte per stabilirsi nel modello e incubate per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Preparazione e caratterizzazione del substrato per colture cellulari sintonizzabili

1. Preparazione del supporto
   1. Miscelare energicamente l'elastomero a base di polidimetilsilossano (PDMS) e gli agenti indurenti utilizzando un puntale per pipetta in un rapporto compreso tra 10:1 e 60:1 fino a quando le bolle non si disperdono in modo omogeneo all'interno della miscela. Rimuovere le bolle utilizzando l'essiccazione sottovuoto fino a quando le bolle non si sono dissipate.
      NOTA: Durante la polimerizzazione PDMS, l'agente indurente si lega con l'elastomero di base per fornire le proprietà meccaniche desiderate del polimero finale. I rapporti di reticolazione possono essere regolati per modificare la rigidità PDMS.
   2. Posizionare una goccia (~0,2 mL) di miscela PDMS essiccata su un vetrino coprioggetti quadrato o circolare (ad esempio, 22 mm x 22 mm) e ruotare il vetrino coprioggetti su una centrifuga a 2500 giri/min per 30 s.
   3. Incubare il vetrino coprioggetti in forno a 60 °C per 1-2 ore o a temperatura ambiente per una notte per la solidificazione del PDMS.
   4. Trattare il vetrino coprioggetti con un detergente all'ozono UV per 7 minuti (lunghezza d'onda UV: 185 nm e 254 nm) per aumentare l'idrofilia superficiale. Metterlo in una piastra sterilizzata a 6 pozzetti.
   5. Prima di utilizzarlo per la coltura cellulare, incubare i substrati in etanolo al 70% per almeno 30 minuti.
      ATTENZIONE: Il detergente UV-Ozono può generare ozono dannoso per l'uomo. Lavorare in una cappa chimica o con una qualche forma di ventilazione.
2. Preparazione del substrato micromodellato
   1. Disegna la geometria desiderata e le aree di adesivo delle celle (900 μm², 1.600 μm² e 2.500 μm²) utilizzando il software di progettazione assistita da computer (CAD). Crea una fotomaschera cromata basata su questi modelli da un fornitore commerciale.
   2. In una camera bianca o in un ambiente privo di polvere, utilizzare tecniche di fotolitografia standard per fabbricare wafer di silicio. I parametri critici per questa particolare applicazione sono i seguenti: Fotoresist: SU-8 2010; Profilo di rotazione per disperdere il fotoresist: 500 giri/min per 10 s con un'accelerazione di 100 giri/min, poi 3500 giri/min per 30 s con un'accelerazione di 300 giri/min; Energia di esposizione della luce UV: 130 mJ/cm2.
      NOTA: L'altezza dei modelli sui wafer di silicio è di circa 10 μm seguendo questi parametri. Potenziali crepe attorno al bordo al di fuori dei modelli rettangolari o triangolari possono essere osservate utilizzando un microscopio ottico dopo il passaggio 1.2.2. La cottura del wafer di silicone a 190 °C per 30 minuti aiuta ad eliminare le crepe.
   3. Posizionare il wafer di silicio modellato all'interno di una piastra di Petri circolare di 150 mm di diametro x 15 mm di altezza e versare il PDMS degassato (rapporto di miscelazione 10:1) come preparato al punto 1.1.1 sul wafer di silicio.
      NOTA: Assicurarsi che lo spessore del PDMS sia di almeno 5 mm per facilitarne la manipolazione durante le fasi di stampa a microcontatto.
   4. Solidificare PDMS su un wafer di silicio in un forno a 60 °C per una notte. Lasciare raffreddare il PDMS a temperatura ambiente. Taglia con precisione timbri quadrati da 30 mm x 30 mm contenenti i modelli corretti dal wafer di silicone utilizzando un bisturi chirurgico. Non danneggiare il wafer di silicone.
      NOTA: I wafer di silicio possono essere riutilizzati molte volte a questo punto per produrre più timbri dopo la pulizia con isopropanolo.
   5. Sterilizzare i timbri PDMS e i vetrini coprioggetti regolabili (preparati nei passaggi da 1.1.1 a 1.1.3) immergendoli in etanolo al 70% per 30 minuti.
   6. Per confermare l'efficacia del micropattern con timbri PDMS dopo la stampa a microcontatto, asciugare la superficie dei timbri PDMS utilizzando un flusso d'aria filtrata e pipettare 50 μg/mL di soluzione di albumina sierica bovina (BSA) (Texas Red coniugata) per coprire l'intero lato modellato del timbro PDMS.
   7. Incubare i timbri PDMS con la soluzione BSA per 1 ora a temperatura ambiente per consentire l'adsorbimento delle proteine.
   8. Asciugare la superficie dei vetrini coprioggetti regolabili utilizzando un flusso d'aria filtrata e aumentare l'idrofilia superficiale come descritto al punto 1.1.5.
   9. Asciugare all'aria i timbri PDMS per rimuovere la soluzione BSA rimanente.
      NOTA: Fare attenzione che la soluzione BSA sia completamente rimossa dal timbro perché qualsiasi soluzione rimanente causerà lo scivolamento dei timbri sul vetrino coprioggetti durante la stampa a microcontatto.
   10. Portare il lato modellato del timbro in contatto conforme con il vetrino coprioggetti regolabile per l'adsorbimento BSA sulla superficie del vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il timbro contro il vetrino coprioggetti per 5 min.
       NOTA: Non applicare una forza eccessiva sul timbro poiché si piegherà e causerà un contatto non specifico tra il timbro e il vetrino coprioggetti. La quantità appropriata di forza applicata al timbro è essenziale per il successo della stampa a microcontatto.
   11. Esaminare il micropattern utilizzando un microscopio a fluorescenza con un filtro FITC (isotiocianato di fluoresceina).
   12. Per stampare le aree adesive delle cellule piuttosto che i modelli fluorescenti, sostituire la laminina con la proteina BSA e ripetere i passaggi da 1.2.5 a 1.2.10.
   13. Rimuovere i timbri dai vetrini coprioggetti e trasferirli in una piastra sterilizzata a 6 pozzetti. Aggiungere 2 mL di soluzione p/v di Pluronic F-127 allo 0,2% in ciascun pozzetto per coprire la superficie del vetrino coprioggetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
       NOTA: Pluronic F-127 può essere adsorbito sulla superficie del PDMS, aumentando l'idrofobicità della superficie del PDMS per bloccare l'adesione delle cellule.
   14. Aspirare la soluzione di Pluronic F-127 e lavare 5 volte con soluzione salina tampone fosfato (PBS) e 1 volta con il terreno di coltura cellulare prima di seminare le cellule. Una densità di semina tipica per le SC è di 1.000 cellule/cm².
   15. 45 minuti dopo la semina cellulare, rimuovere il terreno di coltura cellulare e lavare i vetrini coprioggetti con PBS 2x per evitare che più SC aderiscano allo stesso schema. Mantenere le cellule nell'ambiente di coltura cellulare desiderato per 48 ore prima della quantificazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina da siero bovino (BSA), coniugato rosso del Texas	Thermo Fisher Scientifico	Codice A23017	Colorazione BSA per mostrare i micropattern
Aquila di Dulbecco modificata media	Thermo Fisher Scientifico	11965092	Terreno di coltura cellulare
Siero fetale bovino	Thermo Fisher Scientifico	16000044	Terreno di coltura cellulare supplementare
Fibronectina	Thermo Fisher Scientifico	Codice 33010-018	Proteine utilizzate per rivestire i vetrini coprioggetti
Microscopio a fluorescenza	Nikon	Eclissi Ti2	Microscopio a fluorescenza
Laminina	Thermo Fisher Scientifico	23017015	Proteine utilizzate per rivestire i vetrini coprioggetti
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	15140122	Terreno di coltura cellulare supplementare
Pluronico F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Bloccare il legame con le proteine non specifiche
SYLGARD 184 PDMS base e agente indurente	Sigma Aldrich	761036	Polimero sintonizzabile utilizzato per rivestire i vetrini coprioggetti
Detergente UV-Ozono	Novascan		Aumentare l'idrofilia del PDMS