Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento e coltura di fibroblasti nervosi motori e sensoriali e SC (cellule di Schwann)
- Utilizzare ratti Sprague-Dawley (SD) di sette giorni (n=4) dell'Experimental Animal Center dell'Università di Nantong in Cina. Metti i ratti in una vasca contenente il 5% di isoflurano per 2-3 minuti, lascia che gli animali respirino lentamente e non abbiano attività indipendente, quindi disinfetta usando etanolo al 75% prima della decapitazione.
- Con le forbici tagliare la pelle della schiena per circa 3 cm e rimuovere la colonna vertebrale. Aprire con cautela il canale vertebrale per esporre il midollo spinale.
- Mantenere il midollo spinale in una capsula di Petri da 60 mm con 2-3 ml di soluzione salina bilanciata di D-Hanks ghiacciata (HBSS).
- Sulla base della struttura anatomica, asportare la radice ventrale (nervo motore) e poi la radice dorsale (nervo sensoriale) al microscopio da dissezione. Quindi, mettili in una soluzione salina bilanciata di D-Hanks ghiacciata (HBSS).
- Dopo aver rimosso l'HBSS, tagliare i nervi in pezzi di 3-5 mm con le forbici e digerire con 1 mL di tripsina allo 0,25% (p/v) a 37 °C per 18-20 minuti. Successivamente, integrare con 3-4 ml di DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) per fermare la digestione.
- Pipettare delicatamente la miscela su e giù una decina di volte e centrifugare a 800 x g per 5 minuti. Successivamente, scartare il surnatante e sospendere il precipitato in 2-3 mL di DMEM integrato con il 10% di FBS.
- Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro da 400 mesh, quindi inoculare le cellule in una piastra di Petri da 60 mm e coltivare a 37 °C al 5% di CO2. Dopo 4-5 giorni di coltivazione, isolare i fibroblasti di passaggio 0 (p0) e gli SC dopo aver raggiunto il 90% di confluenza.
- Isolamento e cultura delle SC (Figura 1)
- Lavare le celle una volta utilizzando 1x PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% (p/v) (37 °C) per piastra di Petri da 60 mm per digerire le cellule per 8-10 s a temperatura ambiente. Successivamente, sono stati aggiunti 3 ml di DMEM integrati con il 10% di FBS per fermare la digestione.
- Soffiare delicatamente la miscela con una pipetta per staccare gli SC. Quindi, raccogliere e centrifugare gli SC a 800 x g per 5 minuti.
- Scartare il surnatante e sospendere il residuo in 3 mL di DMEM con il 10% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina, 2 μM di forskolina e 10 ng/mL di HRG, quindi inoculare le cellule in una piastra di Petri da 60 mm non rivestita. Dopo la coltura a 37 °C per 30-45 minuti, i fibroblasti (alcuni fibroblasti vengono digeriti con SC) si attaccano al fondo della capsula.
- Trasferire il surnatante (compresi gli SC) in un altro piatto medio rivestito di poli-L-lisina (PLL) e coltivare a 37 °C per 2 giorni.
