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1. Preparazione della coltura endoteliale di topo in inserti di supporto permeabili
NOTA: Le celle BEND3 sono mantenute secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare il terreno cellulare (BM) BEND3 aggiungendo 50 mL di FBS e 5 mL di penicillina-streptomicina a 500 mL di DMEM e mescolare bene.
- Aspirare il terreno dal piatto e lavare una volta la coltura cellulare BEND3 con 1 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (acido etilendiammina tetraacetico) alle cellule e incubarle per 4 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 1 mL di midollo osseo alle cellule per neutralizzare la tripsina-EDTA e pipettare delicatamente su e giù per dissociare completamente le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta conica da 15 mL e pellettare mediante centrifugazione a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti a 400 x g.
- Aspirare il surnatante dalla provetta e risospendere le cellule con 9 mL di BM fresco, quindi aggiungere 1 mL di sospensione cellulare in un inserto di supporto permeabile. Aggiungere altri 2 mL di BM fresco per pozzetto nella camera inferiore della matrice. Continuare a coltivare le cellule per un giorno.
2. Messa a punto della co-coltura neurale-endoteliale e del sistema di etichettatura Ac4ManNAz
- Un giorno, dopo aver placcato le celle BEND3 negli inserti, aspirare delicatamente prima il terreno nella camera inferiore, poi gli inserti. Lavare la superficie degli inserti 3 volte con DMEM preriscaldato (Dulbecco's modified eagle medium). Lavare la superficie esterna degli inserti risciacquando con DMEM preriscaldato.
- Aggiungere 1 mL di AM (terreno aderente) preriscaldato in un inserto, quindi trasferire gli inserti nei pozzetti con le cellule corticali primarie. Incubare la co-coltura a 37 °C e 5% di CO2 per 12 ore.
- Sciogliere Ac4ManNAz in DMSO (dimetilsolfossido) per ottenere una concentrazione madre di 200 mM. 12 ore dopo aver impostato la co-coltura neurale-endoteliale, aggiungere 1 μL di Ac4ManNAz per camera inferiore e 0,5 μL di stock per inserto nella co-coltura. Agitare immediatamente e delicatamente le piastre per amalgamare bene il terreno. Per le celle di controllo, aggiungere un volume uguale di DMSO.
- Coltivare le cellule per altri 5 giorni a 37 °C e 5% di CO2. Preparare l'AM con 10x bFGF come mezzo di rialimentazione (RM). Durante questo periodo, aggiungere 100 μL di RM per inserto e 200 μL di RM per camera inferiore per rialimentare le cellule endoteliali e neurali a giorni alterni. Durante la rialimentazione, non fornire Ac4ManNAz o DMSO alla coltura.