Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Soluzioni e farmaci
- Soluzione salina fisiologica (PSS)
- Preparare un minimo di 1 L di PSS utilizzando 140 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 2 mM di CaCl2, 1 mM di MgCl2, 10 mM di acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico (HEPES) e 10 mM di glucosio.
- Preparare le soluzioni necessarie prive di CaCl2 (zero Ca2+ PSS) per la dissezione delle arteriole cerebrali e l'isolamento del tubo endoteliale.
nota: Preparare tutte le soluzioni in H2O deionizzato ultrapuro, quindi filtrazione (0,22 μm). Assicurarsi che il prodotto finale contenga un pH 7,4 con osmolalità compresa tra 290 e 300 mOsm.
- Albumina sierica bovina (BSA, 10%)
- Sciogliere 1 g di polvere di BSA liofilizzata in un becher da 10 mL di PSS Ca2+ zero. Coprire il bicchiere e lasciare sciogliere il BSA per almeno 2 ore mescolando lentamente.
- Filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 10 mL più un filtro da 0,22 μm e preparare aliquote da 1 mL da conservare a -20 °C.
- Soluzione di dissezione
- Aggiungere 500 μL di BSA (10%) a 49,5 mL di PSS Ca2+ zero per un volume totale di 50 mL.
- Trasferire la soluzione in una piastra di Petri per dissezioni arteriolari.
- Soluzione di dissociazione
- Aggiungere 5 μL di soluzione di CaCl2 (1 M) e 500 μL di BSA (10%) a 49,5 mL di PSS Ca2+ zero per un volume totale di 50 mL. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- enzimi
- Preparare 1 mL di soluzione digestiva con 100 μg/mL di papaina, 170 μg/mL di ditioeritritolo, 250 μg/mL di collagenasi (miscela di tipo H) e 40 μg/mL di elastasi.
nota: Le attività enzimatiche possono variare, anche se i protocolli di successo richiederanno probabilmente le seguenti attività enzimatiche: ≥ 10 unità/mg per la papaina, ≥ 1 unità/mg per la collagenasi e ≥ 5 unità/mg per l'elastasi.
2. Isolamento delle arteriole parenchimali
NOTA: Le arteriole che nascono dalle arterie cerebrali medie (MCA) e sono incorporate nel parenchima cerebrale sono scelte per questo protocollo. Le arteriole sono isolate come descritto in precedenza11, con modifica.
- Utilizzare perni di acciaio (diametro: 0,2 mm, lunghezza: da 11 a 12 mm) per fissare il cervello isolato in soluzione di dissezione fredda in una capsula di Petri contenente un rivestimento polimerico di silicio infuso di carbone (profondità ≥ 50 cm).
- Utilizzando forbici da dissezione affilate e allineate, tagliare un rettangolo di tessuto cerebrale (lunghezza: 5 mm, larghezza: 3 mm) (Figura 1B) attorno all'MCA, assicurandosi che la parte superiore del segmento di tessuto sia oltre il punto di ramificazione dal Cerchio di Willis. Taglia un altro rettangolo di tessuto cerebrale dall'altro emisfero del cervello per accedere a più arteriole, se necessario.
- Fissare il segmento di tessuto cerebrale separato nel piatto con l'MCA rivolto verso l'alto (distale dal cerchio di Willis) utilizzando perni di acciaio (diametro: 0,1 mm, lunghezza: da 13 a 14 mm). Praticare con cura un'incisione poco profonda vicino ai perni per rimuovere la pia con una piccola pinza, staccandola delicatamente da un'estremità verso l'altra (Figura 1C). Rimuovere la pia dall'altro segmento di tessuto per accedere a più arteriole, se necessario. Fissare con cura la pia isolata con le arteriole parenchimali ramificate da MCA nel piatto con gli spilli, e sezionare le arteriole parenchimali (Figura 1D), assicurandosi che le arteriole non siano danneggiate.
nota: Se le arteriole non vengono facilmente estratte con la pia dal parenchima, usa una pinza sottile e scava nel cervello, iniziando dal punto di diramazione MCA dal Circolo di Willis. Individuare l'arteriola, allentare con cura il tessuto attorno alle arteriole (Figura 1E) ed estrarre delicatamente l'arteriola dal parenchima, tenendo l'estremità superiore dell'arteriola (Figura 1F). Più arteriole (lunghezza: ~1,5-2 mm) possono essere isolate da un rettangolo di tessuto cerebrale.
- Assicurarsi che l'arteriola sia pulita e senza tessuto attaccato ad essa e tagliare i rami distali rimanenti (Figura 2A). Usa questa arteriola pulita e intatta per la digestione enzimatica. In alternativa, tagliare ogni arteriola in due pezzi (lunghezza: 0,75-1 mm) per la digestione enzimatica per la preparazione di tubi endoteliali, se lo si desidera.
3. Digestione delle arteriole parenchimali e preparazione dei tubi endoteliali
- Disposizione delle attrezzature e delle pipette
nota: L'isolamento dei tubi endoteliali arteriosi dal cervello è stato descritto in precedenza13,18. L'attuale protocollo incorpora modifiche per l'isolamento dell'endotelio dalle arteriole parenchimali (intracerebrali). Più arteriole e/o pezzi di arteriole possono essere utilizzati insieme per la digestione enzimatica.
- Assemblare l'apparato di triturazione13 per la preparazione dei tubi endoteliali utilizzando un tavolino in alluminio che supporta una camera e micromanipolatori. Assemblare un microscopio dotato di obiettivi (5x-60x) e una fotocamera collegata al monitor di un computer. Fissare una microsiringa con un controller della pompa accanto al tavolino e al campione.
- Fissare una pipetta di triturazione riempita con olio minerale sul pistone della microsiringa. Utilizzare la microsiringa con il controller della pompa per prelevare la soluzione di dissociazione nella pipetta di triturazione (~130 nL) sopra l'olio minerale, facendo attenzione a evitare bolle d'aria nella pipetta.
- Digestione parziale dei segmenti arteriolari
- Posizionare i segmenti arteriolari intatti in 1 mL di soluzione di dissociazione in una provetta di vetro da 10 mL contenente 100 μg/mL di papaina, 170 μg/mL di ditioeritritolo, 250 μg/mL di collagenasi e 40 μg/mL di elastasi. Incubare i segmenti arteriolari a 34 °C per 10-12 min.
- Dopo la digestione, sostituire la soluzione enzimatica con 3-4 ml di soluzione di dissociazione fresca a temperatura ambiente.
- Isolamento del tubo endoteliale arteriolare
NOTA: Dopo la digestione e la sostituzione della soluzione enzimatica, trasferire uno o più segmenti parzialmente digeriti nella soluzione di dissociazione in una camera di superfusione collegata a una piattaforma mobile. Durante la visualizzazione con un ingrandimento da 100x a 200x, selezionare un segmento del vaso parzialmente digerito ma integro e mettere a fuoco su di esso al microscopio.
- Posizionare la pipetta di triturazione collegata all'iniettore della microsiringa nella soluzione di dissociazione nella camera e posizionarla vicino a un'estremità del segmento del recipiente digerito. Impostare una velocità compresa tra 1 e 3 nL/s sul controller della pompa per una triturazione delicata.
- Mantenendo un ingrandimento da 100x a 200x, prelevare il segmento arteriolare nella pipetta e quindi espellere per dissociare le cellule avventizie e muscolari lisce (Figura 1B). Triturare il segmento del vaso fino a quando tutte le cellule muscolari lisce sono dissociate e solo le cellule endoteliali rimangono come un "tubo" intatto.
nota: Se necessario durante la triturazione, utilizzare con cautela una pinza a punta fine per rimuovere l'avventizia dissociata e la lamina elastica interna dal tubo endoteliale. In genere, solo pochi cicli di triturazione producono un tubo endoteliale intatto.
- Utilizzare micromanipolatori per fissare ciascuna estremità del tubo endoteliale sul vetrino coprioggetti in vetro nella camera con pipette di fissaggio in vetro borosilicato (Figura 2C, D).
- Fissaggio del tubo endoteliale arteriolare
- Sostituire la soluzione di dissociazione con una soluzione di superfusione (PSS contenente 2 mM di CaCl2) assicurandosi che il materiale non endoteliale venga lavato via dalla camera.
- Trasferire il tubo endoteliale fissato nella piattaforma mobile al banco del microscopio progettato per la superfusione continua e le registrazioni/imaging intracellulari o fluorescenti.
- Applicare la distribuzione continua di PSS durante l'esperimento. Impostare manualmente la portata (5-7 mL/min) durante l'esperimento utilizzando la valvola di controllo del flusso in linea, coerentemente con il flusso laminare, facendo corrispondere l'alimentazione del flusso della soluzione all'entità dell'aspirazione del vuoto. Lasciare ≥5 minuti di flusso di PSS verso la camera per la superfusione del tubo endoteliale prima di acquisire i dati di fondo e/o il carico del colorante.
