Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Dissezione del disco intervertebrale bovino
- Sciacquare accuratamente l'intera coda con acqua di rubinetto per rimuovere lo sporco e i peli sulla superficie.
nota: Con le estremità distali intatte, per gli esperimenti è possibile utilizzare un massimo di 9 dischi intervertebrali (IVD) (coccigeo 1-9) per coda a seconda delle dimensioni desiderate degli IVD. Considerando il diametro desiderato tra 15-20 mm, per gli esperimenti abbiamo utilizzato 12 code bovine con 5 IVD per coda.
- Immergere l'intera coda in una scatola contenente una soluzione di betadine all'1% per 10 minuti. Asciugare brevemente la coda con una garza sterile e posizionarla su un telo sterile.
nota: Durante la dissezione del disco, umidificare le code con una garza bagnata con soluzione di Ringer per prevenire la disidratazione. Conservare le code (o i segmenti avanzati) avvolte in una garza bagnata fino al completamento dell'intera procedura di dissezione.
- Utilizzare un bisturi (n. 20) per rimuovere il tessuto molle il più completamente possibile dalla colonna vertebrale caudale per facilitare l'identificazione degli IVD. Rimuovere i processi spinosi e trasversali delle vertebre con una pinza per la rimozione dell'osso.
nota: Selezionare gli IVD con il diametro desiderato. Nello studio attuale sono stati utilizzati IVD con una gamma di diametri di 15-20 mm.
- Tagliare trasversalmente con una pinza ossea al centro di ciascun corpo vertebrale per ottenere segmenti di movimento individuali. Mettere i segmenti di movimento in una capsula di Petri con una garza bagnata con la soluzione di Ringer.
- Localizzare l'IVD e la vertebra mediante palpazione e muovendo delicatamente i segmenti di movimento. Eseguire due tagli paralleli con la sega a nastro nella piastra di crescita degli IVD, uno su ciascun lato dell'IVD. Identificare la posizione della cartilagine di accrescimento toccando e trovando il sito convesso della parte terminale ossea (dura) adiacente al disco (morbida) con una distanza di sicurezza di circa 0,5-1 mm dall'IVD verso la vertebra. Assicurarsi che la lama della sega a nastro sia raffreddata con la soluzione di Ringer durante il taglio delle vertebre.
- Trasferire gli IVD in una capsula di Petri pulita con una garza pulita bagnata con la soluzione di Ringer.
nota: La garza deve essere inumidita e non troppo bagnata per evitare il gonfiore degli IVD,
- Utilizzare la lama del bisturi per raschiare via il corpo vertebrale (osso rosso/rosa), la cartilagine di accrescimento (cartilagine bianca), lasciare intatta la placca terminale (giallo-rosa). Rendere le due superfici piane e parallele per la procedura di caricamento. Trasferire gli IVD raschiati in una capsula di Petri fresca con una garza bagnata con la soluzione di Ringer.
nota: Indossa un guanto di cotta di maglia per proteggere la mano mentre tieni l'IVD e raschi.
- Misurare l'altezza e il diametro del disco con un calibro. Pulire i coaguli di sangue nell'osso delle vertebre con la soluzione di Ringer utilizzando un sistema di lavaggio a getto.
- Trasferire gli IVD in provette di plastica da 50 mL, un IVD per provetta. Aggiungere 25 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) + 10% di penicillina/streptomicina (P/S) per IVD e lasciare agitare per 15 minuti su uno shaker orbitale a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e aggiungere 10 ml di PBS + 1% P/S per IVD per 2 minuti per risciacquare gli IVD.
2. Cultura IVD e caricamento
- Trasferire i dischi nelle camere IVD e aggiungere il terreno di coltura IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L di DMEM ad alto contenuto di glucosio per il gruppo fisiologico e 2 g/L di DMEM a basso contenuto di glucosio per il gruppo patologico) + 1% P/S + 2% di siero fetale di vitello + 1% ITS (contiene 5 μg/mL di insulina, 6 μg/mL di transferrina, e 5 ng/mL di acido selenioso) + 50 μg/mL di ascorbato-2-fosfato + 1% di amminoacido non essenziale + 50 μg/mL di agente antimicrobico per le cellule primarie) e porre in un incubatore a 37 °C, 85% di umidità e 5% di CO2.
- Coltura dei dischi per 4 giorni all'interno di un sistema di bioreattori secondo gruppi sperimentali. Nel gruppo patologico, mantenere le condizioni di carico degenerativo a 0,32-0,5 MPa, 5 Hz per 2 ore/giorno. Nel gruppo di controllo fisiologico, utilizzare un protocollo di carico di 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz per 2 ore/giorno.
nota: Posizionare gli IVD in camere contenenti 5 mL di terreno IVD durante le procedure di caricamento. Il volume dipende dalle dimensioni delle camere di carico del bioreattore. Tra le procedure di caricamento, posizionare gli IVD in piastre a sei pozzetti con 7 mL di terreno di coltura IVD per il recupero del rigonfiamento libero.
- Per analizzare le variazioni dell'altezza del disco durante il periodo sperimentale, misurare l'altezza del disco con un calibro dopo la dissezione IVD (basale) e poi quotidianamente dopo il periodo di rigonfiamento libero e dopo il carico dinamico per la durata dell'esperimento.
