Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane nei neuroni utilizzando lentivirus ingegnerizzati

Abstract

Fonte: Assetta, B., et al., Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per modellare le interazioni neurone-oligodendrociti. (2020).

Questo video dimostra il processo di induzione delle cellule staminali pluripotenti umane a differenziarsi in neuroni trasfettandoli con lentivirus ingegnerizzati che trasportano un gene del fattore di trascrizione neurogenico sotto il controllo dell'elemento responsivo alla tetraciclina, seguito da un trattamento con un derivato della tetraciclina e un mezzo di maturazione.

Protocol

1. Induzione di neuroni umani da cellule staminali pluripotenti umane

1. Preparazione del lentivirus (~5 giorni, protocollo dettagliato come descritto in precedenza)
   1. Piastra ~1 milione di cellule HEK293T in ogni pallone T75 per averle confluenti del ~40% durante l'esecuzione della trasfezione. Trasfettali con plasmidi che esprimono Ngn2 inducibile da tetraciclina e gene resistente alla puromicina (PuroR; sotto lo stesso controllo del promotore TetO), rtTA e i tre plasmidi helper pRSV-REV, pMDLg/pRRE e VSV-G (12 μg di DNA vettore lentivirale e 6 μg di ciascuno del DNA plasmidico helper). Preparare almeno tre fiasche per ogni preparazione di lentivirus. Utilizzare PEI per la trasfezione seguendo le istruzioni del produttore. Sostituire il supporto dopo 16 ore e gettarlo.
   2. Raccogli le particelle virali rilasciate raccogliendo i terreni di coltura ogni giorno e sostituiscili con terreni freschi per 3 giorni. Raggruppare i terreni raccolti contenenti particelle virali per la purificazione. Filtrare il virus attraverso un filtro da 0,22 μm e centrifugare a 49.000 x g per 90 minuti. Risospendere il pellet nel volume appropriato di glucosio PBS (~150 μL).
2. Induzione del neurone (~5 giorni)
   nota: Questo protocollo di induzione (Figura 1A; diagramma di flusso) è altamente efficace sia per le cellule iPS che per le cellule ES di pluripotenza convalidata (che può essere analizzata mediante colorazione immunoistochimica di marcatori di pluripotenza ben caratterizzati; Figura 1B).
   1. Utilizzare cellule ES umane H1 disponibili in commercio al passaggio di 52 (vedi Tabella dei materiali). Coltura delle cellule su piastre a 6 pozzetti rivestite con soluzione di matrice extracellulare (~0,5 mg di soluzione di matrice per piastra a 6 pozzetti; vedere Tabella dei materiali) utilizzando un terreno di mantenimento delle cellule ES (vedere Tabella dei materiali) e incubare le piastre a 37 °C con CO₂ al 5%.
   2. Il giorno -2, staccare le cellule ES (confluenti all'80%) con 1 mL di soluzione di distacco cellulare (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire le cellule in una provetta; lavare il pozzetto con 2 mL di terreno e unire nella stessa provetta. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti, risospendere il pellet in terreno e placcare le cellule su piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice alla densità di semina di 1 x 10₅ celle per pozzetto.
   3. Il giorno -1, aggiungere lentivirus che esprimono Ngn2 più PuroR e rtTA insieme a polibrene (8 μg/ml) alle cellule ES nel terreno di mantenimento delle cellule ES fresche (vedere la Tabella dei materiali). La quantità esatta di virus deve essere determinata dai titoli effettivi o dalla titolazione. In genere aggiungiamo 5 μl per virus per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
   4. Il giorno 0, aggiungere doxiciclina (2 μg/mL per attivare l'espressione di Ngn2) nel terreno DMEM-F12 con integratore di N2 senza morfogeni.
   5. Il giorno 1, aggiungere la puromicina in terreno fresco di DMEM-F12 più N2 e doxiciclina, alla concentrazione finale di 1 μg/mL di terreno. Selezionare le cellule trasdotte in Puromicina per almeno 24 ore. Possono essere necessarie una concentrazione più elevata di Puromicina (fino a 5 μg/mL) e un periodo di selezione più lungo (fino a 48 ore) per rimuovere adeguatamente le cellule sottotrasdotte se il titolo virale è basso.
   6. Il giorno 2, staccare i neuroni differenzianti con una soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali), ri-piastrinarli su piastre a 24 pozzetti (tra 80.000 e 200.000 cellule/pozzetto) rivestite con una soluzione di matrice (vedi Tabella dei materiali) e mantenerli in terreno NBA/B27 senza doxiciclina. La densità di semina è fondamentale.
   7. In questa fase, i neuroni staccati possono essere congelati in un mezzo di congelamento commerciale specializzato (vedi Tabella dei materiali) e conservati in azoto liquido per un massimo di 3 mesi. I neuroni puri possono essere placcati con la tipica morte cellulare del ~15%-20% dopo il disgelo, coltivati da soli o co-coltivati con altri tipi di cellule cerebrali.
   8. Coltura di iNs pure su piastre rivestite con soluzioni a base di matrice extracellulare come indicato dal produttore (vedere la Tabella dei materiali). La caratteristica morfologia piramidale dovrebbe essere evidente entro il Giorno 4 (e il Giorno 6; Figura 1C). La formazione di sinapsi può essere rilevata già dal giorno 14 al giorno 16 ed è prominente al giorno 24 mediante colorazione immunoistochimica con marcatori pre e post-sinaptici standard. (Figura 1D; marcato con il marcatore presinaptico Sinapsina 1 e il marcatore dendritico Map2).

Results

Figura 1: Generazione diretta di neuroni indotti dall'uomo (iN) da hPSC. (A) Diagramma di flusso della generazione di iN. (B) Immagini rappresentative in campo chiaro e in immunofluorescenza della coltura iniziale di cellule staminali pluripotenti umane (H1) per confermare la pluripotenza. Oct4 è mostrato in rosso e Sox2 in verde. (C) Immagini rap...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Tecnologie STEMCELL	Codice: 7920
Supplemento B27	ThermoFisher	17504044
DMEM/F12 medio	Tecnologie STEMCELL	Telefono 36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
Doxiciclina	MilliporeSigma	D3072
Cellule ES umane H1	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Tecnologie STEMCELL	Codice: 5825
Integratore N2	ThermoFisher	17502001
Neurobasale A medio	ThermoFisher	Codice 10888-022
Aminoacidi non essenziali	ThermoFisher	Codice 11140-050
Pei	VWR	71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	Codice: 12251
Polibrene	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	Codice: 12253
Puromicina	ThermoFisher	A1113803
Terreni di congelamento del progenitore neurale STEMdiff	Tecnologie STEMCELL	Codice: 5838
Kit di induzione neurale STEMdiff SMADi	Tecnologie STEMCELL	Codice: 8581
Tempo-iOlogo: OPC umane derivate da iPSC	Tempo BioScience	Codice SKU102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	Codice: 52047
VSV-G	Addgene	Codice: 12259