Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in una popolazione di neuroni in rete

Abstract

Fonte: Hubbard, K. et al., Valutazione funzionale delle neurotossine biologiche in colture in rete di neuroni del sistema nervoso centrale derivati da cellule staminali.J. Vis. Exp. (2015).

Questo video dimostra una tecnica per la differenziazione delle cellule staminali embrionali in una popolazione in rete di neuroni con sinapsi funzionanti. Delinea le fasi coinvolte nella differenziazione delle cellule staminali embrionali in neuroni, nell'induzione della formazione della rete neuronale e nell'arricchimento della coltura con neuroni in rete.

Protocol

1. Differenziazione neuronale

NOTA: Esegui i passaggi 1.1 - 1.5 prima di mezzogiorno e il passaggio 1.7 dopo mezzogiorno. Una panoramica delle procedure di differenziazione è presentata nella Figura 1A.

1. Trasferire 350 μl (3,5 x 10⁶) di ESC in una piastra a bassa apertura da 10 cm contenente 25 ml di terreno di differenziazione. Posizionare su un agitatore orbitale impostato a 30 - 45 giri/min all'interno di un incubatore per colture tissutali a 37 °C con il 5% di CO₂. Questo è il primo giorno di differenziazione, denominato giorno in vitro (DIV) -8,
   nota: L'uso di una piastra a bassissimo attacco aumenta il costo del metodo, ma produce rese leggermente maggiori rispetto alle piastre di Petri batteriche, poiché gli aggregati possono occasionalmente aderire alle piastre di Petri. Se si preferiscono piatti di dimensioni diverse, è possibile scalare di conseguenza i volumi medi e il numero di celle.
2. Dopo 48 ore (DIV -6), utilizzare una pipetta da 25 ml per trasferire gli aggregati cellulari differenzianti in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere immediatamente 25 ml freschi di terreno di differenziazione alla piastra di Petri.
3. Lasciare sedimentare gli aggregati per 2 - 5 minuti, producendo un pellet visibile profondo 1 - 2 mm. Ignora le singole celle o i piccoli aggregati rimasti in sospensione. Aspirare con cura il terreno e trasferire nuovamente il pellet di cella nella capsula di Petri utilizzando un P1000. Posizionare sull'agitatore rotante in un incubatore per colture tissutali.
4. A DIV -4, ripetere il passaggio 1.2. Il pellet avrà una profondità di 2 - 4 mm. Sostituire 30 ml di terreno di differenziazione integrato con 6 μM di acido retinoico (RA) all-trans nella capsula di Petri. Rimettere all'agitatore rotante nell'incubatore per colture tissutali per altre 48 ore.
5. A DIV -2, ripetere il passaggio 1.3. A questo punto il pellet avrà una profondità di 4 - 8 mm.
6. A DIV -1, preparare le superfici di placcatura come nella Sezione 2.
7. A DIV 0, scongelare 5 ml di terreno di tripsinizzazione NPC pre-aliquotato e congelato a 37 °C per 5 - 10 minuti e porlo in una cappa di coltura tissutale. Utilizzando una pipetta da 25 ml, trasferire gli aggregati differenzianti in una provetta conica da 50 ml. Lasciare depositare gli aggregati e aspirare con cura il substrato. Lavare il pellet due volte con 10 ml di PBS, lasciando che gli aggregati si depositino tra un lavaggio e l'altro.
8. Dopo il secondo lavaggio PBS, aggiungere 5 ml di terreno di tripsinizzazione NPC al pellet e incubare a 37 °C per 5 minuti. Muovere delicatamente la provetta dopo 2,5 minuti.
9. Aggiungere 5 ml di inibitore della tripsina di soia allo 0,1% (IST) per inattivare la tripsina e mescolare invertendo. Triturare delicatamente 10 - 15 volte con una pipetta sierologica da 10 ml fino a produrre una sospensione cellulare relativamente omogenea.
10. Trasferire lentamente la sospensione cellulare in un filtro cellulare da 40 μm o 70 μm posizionato sulla parte superiore di una provetta conica da 50 ml. Una volta che tutta la sospensione è stata filtrata, aggiungere 1 ml di terreno N2 per lavare le cellule rimanenti attraverso il filtro e pellettare la sospensione cellulare dissociata per 6 minuti a 200 x g.
11. Aspirare il fluido senza disturbare il pellet. Lavare le celle due volte con 10 ml di terreno N2, pellettare le celle per 5 minuti a 200 x g e triturare tra i lavaggi con un P1000. Prima del secondo lavaggio, contare le cellule utilizzando un emocitometro.
12. Risospendere le cellule nel terreno N2 a 1 x 10⁷ cellule per ml e le ESN su piastra a una densità cellulare di 150.000 - 200.000 cellule/cm².
13. Trasferire gli ESN appena piastrati in un incubatore per colture tissutali umidificato a 37 °C e 5% di CO₂ e mantenerli come indicato nella Sezione 3.

2. Preparazione delle superfici di coltura per la placcatura dei precursori neurali a DIV 0

1. Preparare i piatti trattati con coltura tissutale almeno 1 giorno prima della piastra. Aggiungere una quantità sufficiente di polietilenimmina (PEI; 25 μg/ml in H₂O sterile) o poli-D-lisina (PDL; 100 μg/ml in H₂O sterile) per coprire le piastre di plastica trattate con coltura tissutale e incubare O/N a 37 °C.
2. La mattina dell'impiattamento, lavare le stoviglie due volte con H₂O a doppia distillazione e una volta con PBS. Dopo il lavaggio finale, aggiungere una quantità sufficiente di terreno N2 per coprire la piastra (ad esempio, 1 ml per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti o 4 ml per piastra da 6 cm).
3. Preparare vetrini coprioggetti in vetro da 18 mm almeno un giorno prima della placcatura dei neuroni. Pulire i vetrini coprioggetti con la pulizia al plasma per 4 minuti.
4. Trasferire immediatamente i vetrini coprioggetti puliti su un parafilm lavato con etanolo sul fondo di una grande capsula sterile e aggiungere 400 μl di soluzione di PEI o PDL, preparata come al punto 2.1. Incubare O/N a 37 °C in un incubatore per colture tissutali.
5. Al mattino, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con acqua e aggiungere 5 μg/ml di laminina in PBS per 1 - 3 ore a 37 °C. Prima di dissociare i neuroni, aspirare la laminina e trasferire immediatamente il vetrino coprioggetti in un pozzetto di una capsula a 12 pozzetti contenente 1 ml di terreno NPC, assicurandosi di mantenere il lato trattato rivolto verso l'alto.
6. Conservare le stoviglie e i vetrini coprioggetti a 37 °C fino a quando gli NPC non sono pronti per l'impiattamento.

3. Manutenzione dei neuroni

1. Al DIV 1, aspirare il terreno e sostituirlo con il terreno di coltura N2.
2. Ai punti DIV 2 e 4, aspirare il terreno e sostituirlo con il terreno di coltura B27.
3. Al DIV 8, aspirare il terreno e sostituirlo con un terreno di coltura B27 contenente inibitori mitotici per eliminare le cellule non neuronali contaminanti.
4. Al DIV 12, sostituire con terreno di coltura B27.
5. Non rimuovere gli ESN DIV 12⁺ dal 5% di CO₂ fino al momento dell'uso.

Results

Figura 1. Gli ESN adattati alla sospensione rimangono mitoticamente stabili ed esprimono marcatori di pluripotenza.(A) Schema della manutenzione e differenziazione dell'ESC. La presenza o l'assenza di acido retinoico (RA) o fattore inibitorio della leucemia (LIF) è contrassegnata da un + o –. Viene fornito un confronto tra i giorni in vitro (DIV) e gli stadi di sviluppo clas...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM	Tecnologie per la vita	Codice 10829-018	Terreno: Terreno di coltura ESC Formulazione e note: 500 mL
100x MEM NEAA	Tecnologie per la vita	Codice 11140-050	Terreno: conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese Formulazione e note: 6 mL
200 mM di L-Alanil-L-Glutammina	ATCC	30-2115	6 ml
FBS qualificato ES	Cellule staminali applicate	ASM-5007	90 ml
100x antibiotici	Sigma-Aldrich	Codice: A5955	3 ml
55 mM di 2-mercaptoetanolo	Tecnologie per la vita	Codice: 21985-023	1,1 ml
107 Unità/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μl
Knockout DMEM	Tecnologie per la vita	Codice 10829-018	Terreno: Terreno di differenziazione ESC Formulazione e note: 436,6 mL
100x MEM NEAA	Tecnologie per la vita	Codice 11140-050	Terreno: conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese Formulazione e note: 5 mL
200 mM di L-Alanil-L-Glutammina	ATCC	30-2115	5 ml
Siero qualificato ESC	Cellule staminali applicate	ASM-5007	50 ml
100x antibiotici	Sigma-Aldrich	Codice: A5955	2,5 ml
55 mM di 2-mercaptoetanolo	Tecnologie per la vita	Codice: 21985-023	0,9 ml
La PBS di Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Terreno: Terreno di tripsinizzazione NPC Formulazione e note: 100 mL
0,5 milioni di EDTA (18,3%)	Sigma-Aldrich	3690	Terreno: congelare in 5 mL di aliquota Formulazione e note: 0,266 mL
tripsina	Sigma-Aldrich	Codice: T8802	50 mg
Polietilenimmina (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Terreno: Soluzioni di rivestimento superficiale Formulazione e note: 2,5 μg/mL in H20
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma-Aldrich	P7280	Terreno: utilizzare entro 1 settimana Formulazione e note: 100 μg/mL in H20
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/mL in H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Tecnologie per la vita	Codice 10565-018	Terreno: Terreno di coltura NPC Formulazione e note: 492,5 mL
100x vitamine N2	Tecnologie per la vita	Codice 17502-048	Terreno: conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese Formulazione e note: 5 mL
100x antibiotici	Sigma-Aldrich	Codice: A5955	2,5 ml
Neurobasale A	Tecnologie per la vita	Codice 10888-022	Terreno: Terreno di coltura ESN Formulazione e note: 482,5 mL
50x vitamine B27	Tecnologie per la vita	Codice 17504-044	Terreno: conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese Formulazione e note: 10 mL
200 mM di L-Alanil-L-Glutammina	ATCC	30-2115	5 ml
100x antibiotici	Sigma-Aldrich	Codice: A5955	2,5 ml
5-fluoro-2'-deossiuridina (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Terreno: 2000x inibitori mitotici aliquotare e conservare a -20 °C Formulazione e note: dd 150 mg 5FDU e 350 mg di uridina a 10 mL Neurobasal A. Filtro sterile, aliquotare e congelare. Utilizzare 2000x nel terreno di coltura ESN.
uridina	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Express Tripsina	Tecnologie per la vita	Codice 12605-010	Media: Varie Formulazione e note: conservare presso RT
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	negozio presso RT
inibitore della tripsina di soia (IST)	Sigma-Aldrich	T6414	conservare a -20 °C
etanolo	Sigma-Aldrich	E7023	negozio presso RT
acido ascorbico	Sigma-Aldrich	Codice: A4403	Preparare 100 mM di brodo sciogliendo 100 mg di acido ascorbico in 5,7 mL di miscela 50:50 DMSO/etanolo.
acido retinoico (RA)	Sigma-Aldrich	Codice: R2625	Risospendere 15 mg di AR in 9 mL di DMSO/etanolo 50:50. Integrare con 1 mL di brodo di acido ascorbico 100 mM. Aliquotare e conservare a -80 °C. Stabile per 6 mesi.
pulitore al plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Microscopio invertito Olympus IX51	Olimpo	N/A
vetrini coprioggetti in vetro da 18 mm	pescatore	12-545-84
Filtro cellulare (40 μm)	pescatore	08-771-1
Stovall Danzatrice del ventre shaker	pescatore	Codice 15-453-211
Piatti a bassa adesione	pescatore	05-539-101	Corning 3262
Piastre batteriche	VWR	Codice 25384-302	100 x 15 millimetri