1. Differenziazione neuronale
NOTA: Esegui i passaggi 1.1 - 1.5 prima di mezzogiorno e il passaggio 1.7 dopo mezzogiorno. Una panoramica delle procedure di differenziazione è presentata nella Figura 1A.
- Trasferire 350 μl (3,5 x 106) di ESC in una piastra a bassa apertura da 10 cm contenente 25 ml di terreno di differenziazione. Posizionare su un agitatore orbitale impostato a 30 - 45 giri/min all'interno di un incubatore per colture tissutali a 37 °C con il 5% di CO2. Questo è il primo giorno di differenziazione, denominato giorno in vitro (DIV) -8,
nota: L'uso di una piastra a bassissimo attacco aumenta il costo del metodo, ma produce rese leggermente maggiori rispetto alle piastre di Petri batteriche, poiché gli aggregati possono occasionalmente aderire alle piastre di Petri. Se si preferiscono piatti di dimensioni diverse, è possibile scalare di conseguenza i volumi medi e il numero di celle.
- Dopo 48 ore (DIV -6), utilizzare una pipetta da 25 ml per trasferire gli aggregati cellulari differenzianti in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere immediatamente 25 ml freschi di terreno di differenziazione alla piastra di Petri.
- Lasciare sedimentare gli aggregati per 2 - 5 minuti, producendo un pellet visibile profondo 1 - 2 mm. Ignora le singole celle o i piccoli aggregati rimasti in sospensione. Aspirare con cura il terreno e trasferire nuovamente il pellet di cella nella capsula di Petri utilizzando un P1000. Posizionare sull'agitatore rotante in un incubatore per colture tissutali.
- A DIV -4, ripetere il passaggio 1.2. Il pellet avrà una profondità di 2 - 4 mm. Sostituire 30 ml di terreno di differenziazione integrato con 6 μM di acido retinoico (RA) all-trans nella capsula di Petri. Rimettere all'agitatore rotante nell'incubatore per colture tissutali per altre 48 ore.
- A DIV -2, ripetere il passaggio 1.3. A questo punto il pellet avrà una profondità di 4 - 8 mm.
- A DIV -1, preparare le superfici di placcatura come nella Sezione 2.
- A DIV 0, scongelare 5 ml di terreno di tripsinizzazione NPC pre-aliquotato e congelato a 37 °C per 5 - 10 minuti e porlo in una cappa di coltura tissutale. Utilizzando una pipetta da 25 ml, trasferire gli aggregati differenzianti in una provetta conica da 50 ml. Lasciare depositare gli aggregati e aspirare con cura il substrato. Lavare il pellet due volte con 10 ml di PBS, lasciando che gli aggregati si depositino tra un lavaggio e l'altro.
- Dopo il secondo lavaggio PBS, aggiungere 5 ml di terreno di tripsinizzazione NPC al pellet e incubare a 37 °C per 5 minuti. Muovere delicatamente la provetta dopo 2,5 minuti.
- Aggiungere 5 ml di inibitore della tripsina di soia allo 0,1% (IST) per inattivare la tripsina e mescolare invertendo. Triturare delicatamente 10 - 15 volte con una pipetta sierologica da 10 ml fino a produrre una sospensione cellulare relativamente omogenea.
- Trasferire lentamente la sospensione cellulare in un filtro cellulare da 40 μm o 70 μm posizionato sulla parte superiore di una provetta conica da 50 ml. Una volta che tutta la sospensione è stata filtrata, aggiungere 1 ml di terreno N2 per lavare le cellule rimanenti attraverso il filtro e pellettare la sospensione cellulare dissociata per 6 minuti a 200 x g.
- Aspirare il fluido senza disturbare il pellet. Lavare le celle due volte con 10 ml di terreno N2, pellettare le celle per 5 minuti a 200 x g e triturare tra i lavaggi con un P1000. Prima del secondo lavaggio, contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Risospendere le cellule nel terreno N2 a 1 x 107 cellule per ml e le ESN su piastra a una densità cellulare di 150.000 - 200.000 cellule/cm2.
- Trasferire gli ESN appena piastrati in un incubatore per colture tissutali umidificato a 37 °C e 5% di CO2 e mantenerli come indicato nella Sezione 3.
2. Preparazione delle superfici di coltura per la placcatura dei precursori neurali a DIV 0
- Preparare i piatti trattati con coltura tissutale almeno 1 giorno prima della piastra. Aggiungere una quantità sufficiente di polietilenimmina (PEI; 25 μg/ml in H2O sterile) o poli-D-lisina (PDL; 100 μg/ml in H2O sterile) per coprire le piastre di plastica trattate con coltura tissutale e incubare O/N a 37 °C.
- La mattina dell'impiattamento, lavare le stoviglie due volte con H2O a doppia distillazione e una volta con PBS. Dopo il lavaggio finale, aggiungere una quantità sufficiente di terreno N2 per coprire la piastra (ad esempio, 1 ml per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti o 4 ml per piastra da 6 cm).
- Preparare vetrini coprioggetti in vetro da 18 mm almeno un giorno prima della placcatura dei neuroni. Pulire i vetrini coprioggetti con la pulizia al plasma per 4 minuti.
- Trasferire immediatamente i vetrini coprioggetti puliti su un parafilm lavato con etanolo sul fondo di una grande capsula sterile e aggiungere 400 μl di soluzione di PEI o PDL, preparata come al punto 2.1. Incubare O/N a 37 °C in un incubatore per colture tissutali.
- Al mattino, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con acqua e aggiungere 5 μg/ml di laminina in PBS per 1 - 3 ore a 37 °C. Prima di dissociare i neuroni, aspirare la laminina e trasferire immediatamente il vetrino coprioggetti in un pozzetto di una capsula a 12 pozzetti contenente 1 ml di terreno NPC, assicurandosi di mantenere il lato trattato rivolto verso l'alto.
- Conservare le stoviglie e i vetrini coprioggetti a 37 °C fino a quando gli NPC non sono pronti per l'impiattamento.
3. Manutenzione dei neuroni
- Al DIV 1, aspirare il terreno e sostituirlo con il terreno di coltura N2.
- Ai punti DIV 2 e 4, aspirare il terreno e sostituirlo con il terreno di coltura B27.
- Al DIV 8, aspirare il terreno e sostituirlo con un terreno di coltura B27 contenente inibitori mitotici per eliminare le cellule non neuronali contaminanti.
- Al DIV 12, sostituire con terreno di coltura B27.
- Non rimuovere gli ESN DIV 12+ dal 5% di CO2 fino al momento dell'uso.
