Separazione magnetica delle cellule di Schwann dai nervi sciatici di topo

Abstract

Fonte: Blusch, A., et al., Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio della radice dorsale di ratto e cellule di Schwann. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule di Schwann dalle fibre del nervo sciatico di topo.

Protocollo

1. Coltura cellulare di Schwann

1. Rivestimento per colture cellulari di Schwann
   1. Rivestire le piastre per colture cellulari in condizioni sterili. Applicare 2 mL di poli-L-lisina (PLL) allo 0,01% su due piastre di coltura tissutale (TC) da 60 mm ciascuna e incubare per una notte a 4 °C.
   2. Rimuovere il PLL, lavare le piastre TC 2 volte con acqua distillata e incubare con 2 ml di 1 μg/cm² di laminina per una notte a 4 °C. Lavare le piastre TC 2 volte con acqua e lasciare asciugare le piastre all'aria.
2. Preparazione del terreno per la coltura cellulare di Schwann
   1. Preparare 50 mL di terreno cellulare di Schwann aggiungendo il 10% di siero fetale di vitello inattivato termicamente (FCS), 2 μM di forskolina, 10 nM di neuregulina e 50 μg/mL di gentamicina al Modified Eagle's Medium (DMEM)/F-12 (high glucose) di Dulbecco in condizioni sterili.
   2. Preparare 70 mL di terreno L-15 di Leibovitz con 50 μg/mL di gentamicina in condizioni sterili.
3. Digestione enzimatica del nervo sciatico
   NOTA: I passaggi successivi vengono eseguiti in condizioni sterili.
   1. Preparare la soluzione di digestione enzimatica contenente lo 0,25% di dispasi II, lo 0,05% di collagenasi di tipo I e 50 μg/mL di gentamicina in 10 mL di DMEM (glucosio alto).
   2. Centrifugare la provetta a 188 x g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica da 25 ml e trasferire il pellet con il terreno L-15 di Leibovitz rimanente in una piastra per coltura tissutale da 60 mm utilizzando una pipetta da 1.000 ml.
   3. Sciacquare la provetta da 50 ml con 10 ml di soluzione per la digestione enzimatica e aggiungerla al piatto contenente le fibre nervose. Distribuire accuratamente il fazzoletto nel piatto con la punta di una pipetta per massimizzare la superficie accessibile per la digestione.
   4. Incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 18 ore e interrompere la digestione aggiungendo 10 mL di FCS al 40% nella soluzione salina bilanciata di Hanks, senza Ca²⁺ e Mg²⁺ (HBSS).
4. Separazione cellulare
   1. Trasferire i nervi digeriti in una provetta da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica e centrifugare a 188 x g per 10 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di DMEM contenente il 10% di FCS e 50 μg/mL di gentamicina. Risospendere il pellet 20 volte in seguito, utilizzando un puntale per pipette da 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL e 200 μL.
   2. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 μm e centrifugare a 188 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 4 mL di DMEM contenente il 10% di FCS e 50 μg/mL di gentamicina.
   3. Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare a ciascuna delle due piastre TC da 60 mm rivestite con PLL e laminina e incubare a 37 °C e 5% di CO₂. Lasciare intatte le piastre per 2 giorni nell'incubatore per proteggere le cellule dalle sollecitazioni meccaniche e per favorirne l'aderenza.
5. Differenziazione cellulare di Schwann
   1. Dopo 2 giorni, rimuovere il terreno e sciacquare accuratamente le piastre 2 volte con DMEM (glucosio alto), 10% FCS e 50 μg/mL di gentamicina. Successivamente, aggiungere 2 ml di terreno cellulare di Schwann. Sostituire il terreno cellulare di Schwann ogni 2 giorni e osservare l'aspetto e la confluenza delle cellule utilizzando un microscopio.
6. Tripsinizzazione cellulare e separazione magnetica
   1. Quando le cellule raggiungono una confluenza di circa l'80% (6-12 giorni di coltura), lavare accuratamente le piastre 2 volte con 3 mL di DPBS e incubare con 2 mL di tripsina/EDTA allo 0,05% (preriscaldato a 37 °C) per 3 minuti. Quando le cellule si staccano dal fondo della piastra, inattivare la digestione con l'aggiunta di 2 mL di DMEM con FCS al 10% e 50 μg/mL di gentamicina.
      nota: Attenersi a un tempo di tripsinizzazione di 3 minuti e procedere rapidamente dopo.
   2. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di tampone magnetico di separazione cellulare contenente DPBS con albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e EDTA 2 nM. Combinare 10 μl di sospensione cellulare con 10 μl di blu di tripano e contare le cellule utilizzando una camera di colorazione.
   3. Centrifugare la sospensione cellulare a 188 x g per 10 minuti a 4 °C e risospendere il pellet della cella in 90 μl di tampone magnetico di separazione cellulare per 1 x 10⁷ cellule. Aggiungere 10 μl di microsfere di Thy-1 per 1 x 10⁷ cellule. Risospendere la soluzione alcune volte e incubare per 15 minuti al buio a 8 °C.
   4. Aggiungere 2 mL di tampone di separazione magnetica alla sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone di separazione magnetica per cellule.
   5. Inumidire la colonna di separazione delle celle magnetiche con 1 mL del tampone di separazione delle celle magnetiche. Posizionare la colonna di separazione magnetica delle celle nel separatore magnetico delle celle. Applicare le celle alla colonna magnetica di separazione delle celle. Raccogliere il flusso e centrifugare a 300 x g a 4 °C per 10 min.
      nota: I fibroblasti vengono selezionati positivamente e rimangono nella colonna, mentre le cellule di Schwann passano la colonna. I fibroblasti possono essere raccolti con un timbro (ad esempio, come controllo negativo per i protocolli di colorazione delle cellule di Schwann).
   6. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno di cocoltura. Contare le cellule dopo la colorazione con blu di tripano e una camera di colorazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina	Carl Roth, Karlsruhe, Germania	8076.4
Filtro cellulare, 100 μM	BD Bioscience, Heidelberg, Germania	Codice 352360
Centrifuga 5810-R	Eppendorf AG, Amburgo, Germania	5811000015
incubatore a CO2 Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germania	51017865
Applicazione II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania	4942078001
Acqua distillata (sistema di purificazione dell'acqua)	Millipore, Molsheim, Francia	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania	31331093
DPBS (senza ioni calcio e senza ioni magnesio)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania	D8537-6X500ML
Fcs	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania	F7524	FCS deve essere testato per la coltura cellulare di Schwann
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania	5710064
HBSS (senza ioni calcio e senza ioni magnesio)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania	14170138
Laminina	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania	L2020-1MG
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania	130042303
Microforbici	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania	Codice 15000-08
microscopio	Motic, Wetzlar, Germania	Motic BA 400
Vetrino per microscopio	VWR, Radnor, Stati Uniti	630-1985
Separatore MiniMACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania	130091632
Colonne MS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania	Codice 130-042-201
Camera di conteggio Neubauer	Assistente, Erlangen, Germania	Numero 40441
Pipette	Eppendorf AG, Amburgo, Germania	2231300004
Poli-L-lisina	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania	P4707-50ML
Pipetta sierologica, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germania	861254025
Pipetta sierologica, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germania	861685001
Pipetta sierologica, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germania	861253001
Piatto TC 60, cella +	Sarstedt, Nümbrecht, Germania	833901300
Microsfere Thy-1 (kit MACS)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania	Codice 130-094-523
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania	Codice 25300-054
Collagenasi di tipo I	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania	C1639
Bagnomaria tipo 1008	GFL, Burgwedel, Germania	Codice: 4285