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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione di una soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio e di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)
- Prima del giorno sperimentale
- Preparare 1 L di 10 fette di pre-soluzione con acqua di tipo 1 di grado da laboratorio contenente (in mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tabella 1). Per evitare la precipitazione del fosfato di calcio, mescolare lentamente le sostanze chimiche in un becher pre-riempito con 800 mL di H2O, agitando costantemente con un agitatore magnetico. Conservare la soluzione a 4 °C o a temperatura ambiente (RT).
- Il giorno dell'esperimento
- Preparare 1 L di 1x ACSF con acqua di tipo 1 di laboratorio contenente (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 glucosio (Tabella 2). Utilizzare un osmometro a pressione di vapore per convalidare l'osmolarità tra 305-315 mOsm (pH ~ 7,55-7,6).
nota: Per evitare la precipitazione del fosfato di calcio, mescolare lentamente tutte le sostanze chimiche solide in un becher pre-riempito con 800 mL di H2O, mescolando costantemente con un agitatore magnetico. Aggiungere MgSO4 e CaCl2 alla fine, gocciolando lentamente la quantità necessaria da 1 M di soluzioni madri.
- Far bollire continuamente 1 soluzione ACSF a RT con carbogeno per impostare il pH tra 7,3 e 7,4,
nota: Se il pH è leggermente troppo alto o troppo basso, sarebbero sufficienti piccoli aggiustamenti della forza di carbogenazione. Se il pH è superiore a 7,45 con la carbogenazione, regolarlo aggiungendo alcune gocce di soluzione 1 M NaH2PO4.
- Preparare 250 mL (per cervello) di 1 soluzione di fetta ad alto contenuto di saccarosio in un becher contenente 25 mL di pre-soluzione di 10 fette e (in mM): 252 saccarosio, 26 NaHCO3 e 10 glucosio (Tabella 3). Verificare che l'osmolarità sia compresa tra 320 e 325 mOsm (pH ~ 7,55-7,6).
- Far bollire la soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio per 10-15 minuti con carbogeno per controllare il pH tra 7,3 e 7,4,< >
nota: Se il pH è superiore a 7,45 con la carbogenazione, regolarlo aggiungendo alcune gocce di soluzione 1 M KH2PO4.
- Conservare la soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio per 20-30 minuti nell'ultra congelatore (-80 °C) fino a quando non sarà parzialmente congelata.
2. Dissezione e posizionamento del cervello murino
- Trasferire il cervello nel piatto di coltura raffreddato da 35 mm e rimuovere tutti i peli o le particelle di sangue dal tessuto lavando delicatamente il cervello con una pipetta Pasteur riempita di ACSF (il sangue ha effetti citotossici sul tessuto cerebrale).
- Trasferire il cervello con l'aiuto della spatola sulla carta da filtro imbevuta sopra il piatto di coltura raffreddato da 90 mm (Figura 1A).
- Usa una lama per tagliare il cervello a metà, separando i due emisferi, e posiziona entrambi gli emisferi sul lato mediale appena tagliato.
- Utilizzare una lama per rimuovere la parte dorsale (5%-10%) del cervello da ciascun emisfero con un taglio parallelo alla parte superiore dorsale (Figura 1C) e posizionare entrambi gli emisferi sul lato appena tagliato con la parte ventrale del cervello rivolta verso l'alto.
- Posizionare una goccia di super colla sulla piastra del campione e stenderla correttamente con la punta di una pipetta per accogliere entrambi gli emisferi.
- Utilizzare una fascetta di carta da filtro per raccogliere un emisfero con forze capillari toccando il lato ventrale con la fascetta di carta da filtro, senza danneggiare così il tessuto.
- Utilizzare un'altra cinghia di carta da filtro per semi-asciugare accuratamente il lato dorsale del cervello prima di posizionare l'emisfero, con il lato dorsale rivolto verso il basso, sopra la colla sulla piastra del campione. Ripetere la stessa procedura con il secondo emisfero.
nota: Gli emisferi devono essere posizionati in allineamento orizzontale in modo speculare sulla piastra del vibratomo, con i lati rostrali rivolti verso l'esterno e i lati caudali rivolti (ma non toccanti) l'uno verso l'altro al centro. I lati mediali di entrambi gli emisferi dovrebbero puntare verso la lama del vibratomo e i lati laterali verso lo sperimentatore (Figura 1D).
- Posizionare la piastra per campioni nella camera di affettatura e coprirla rapidamente, ma con cura, con una granita ghiacciata ad alto contenuto di saccarosio. Non appena la soluzione tocca la colla, si solidificherà e incollerà correttamente gli emisferi alla piastra del campione.
- Assicurarsi che gli emisferi siano adeguatamente coperti con una soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio e confermare che la soluzione sia gorgogliata con carbogen.
nota: L'intera procedura di dissezione deve essere eseguita il più velocemente possibile. Assicurati che il cervello non rimanga senza l'apporto di ossigeno per molto tempo. Dovrebbe volerci solo circa 1-1,5 minuti dalla decapitazione all'immersione del cervello nella granita ad alta fetta di saccarosio. Questo è il requisito più critico per le preparazioni acute di fette cerebrali al fine di garantire un'alta qualità della fetta.
3. Taglio orizzontale del cervello
- Posizionare la lama del vibratomo davanti al lato mediale degli emisferi e abbassarla alla stessa altezza dei lati ventrali degli emisferi che ora sono rivolti verso l'alto. Abbassare la lama con l'aiuto del controllo del vibratomo a 600 μm in direzione dorsale e iniziare ad affettare. La lama dovrebbe colpire il tessuto (in caso contrario, invertire la lama e abbassarla un po' di più). Affettare fino a quando le prime due fette sono completamente separate dai due emisferi.
- Invertire la lama e abbassare di altri 300 μm e affettare di nuovo.
- Quando l'ippocampo diventa visibile (utilizzare l'atlante cerebrale del topo per aiuto, se necessario) (Figura 1E) raccogliere le fette con la pipetta di plastica Pasteur allargata. Raccogli le fette fino a quando il putamen caudato diventa visibile vicino all'ippocampo. In genere, si possono raccogliere tra 8 e 12 fette di 300 μm (4-6 per emisfero) per il cervello del topo.
- Utilizzare la pipetta di plastica Pasteur per raccogliere le fette e trasferirle nella camera di recupero nel bagno d'acqua (Figura 1F) (raccogliere le fette dopo ogni ciclo di affettatura per evitare che galleggino nella camera delle fette).
nota: Lavora il più velocemente possibile e assicurati che la soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio sia ghiacciata e carbogenata durante l'intera procedura. Se necessario, riempire nuovamente il ghiaccio che circonda la camera delle fette.
4. Recupero di fette di cervello per registrazioni elettrofisiologiche
- Lasciare le fette nella camera di recupero riempita di ACSF nel bagno d'acqua a 32 °C per 1 h.
NOTA: Le camere di recupero sono disponibili anche in commercio.
- Estrarre la camera di recupero dal bagnomaria.
- Posizionare le fette a RT per almeno altri 30 minuti per il recupero prima di iniziare qualsiasi ulteriore applicazione.
Buffer e Ricette Media.
Tabella 1: 10 x pre-soluzione a fette (1 L).
| composto | Concentrazione (mM) | Peso molecolare (g/mol) | Quantità (g) |
| Kcl | 25 | 74,55 | 1,86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147,01 | 2,94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | 246,48 | 2.46 |
| KH2PO4 | 12.5 | Codice 136,08 | 1.7 |
Tabella 2: 1x ACSF (1 L) (osmolarità tra 305-315 mOsm).
| composto | Concentrazione (mM) | Peso molecolare (g/mol) | Quantità (g) |
| NaCl | 125 | 58.44 | 7.3 |
| Kcl | 2.5 | 74,55 | 0,19 |
| CaCl2 * 2H2O | numero arabo | da 1 M soluzione CaCl2 | 2 ml |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | da 1 M soluzione di MgSO4 | 1 ml |
| NaH2PO4 * 2H2O | 1.25 | 156,02 | 0,2 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 2.18 |
| Glucosio * H2O | 25 | 198,17 | 4.95 |
Tabella 3: 1x soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio (250 mL) (osmolarità tra 320-325 mOsm).
| composto | Concentrazione (mM) | Peso molecolare (g/mol) | Quantità (g) |
| 10x presoluzione di fette | N/A | N/A | 25 ml |
| saccarosio | 252 | 342,3 | Ore 21.57 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 0,55 |
| Glucosio * H2O | 10 | 198,17 | 0,49 |
