Generazione di fette di amigdala inclinate da un cervello di topo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Bosch, D., et al. Dissezione optogenetica ex vivo dei circuiti della paura in fette di cervello. J. Vis. Exp. (2016)

Il video mostra la generazione di fette di amigdala inclinate dal cervello di un topo. Il cervello è posizionato ad angolo sullo stadio del campione di vibratomo per ottenere fette contenenti l'amigdala e gli assoni dalla corteccia prefrontale mediale che formano connessioni sinaptiche con l'amigdala. Le fette di cervello vengono mantenute alla temperatura fisiologica per preservare il tessuto per ulteriori esperimenti.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione di fette acute

Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), la soluzione di taglio, gli strumenti (forbici, bisturi, pinze, spatola, pipetta Pasteur) e blocchi di agar.
Nota: per ogni esperimento è necessario 1 litro di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) e viene preparato sciogliendo sostanze chimiche in H₂O a doppia distillazione, come precedentemente pubblicato. La soluzione di taglio viene preparata integrando 200 ml di ACSF con 0,87 ml di soluzione madre 2 M MgSO₄.
Ossigenare ACSF e soluzione di taglio durante l'esperimento con il 95% di O₂ e il 5% di CO_2.
Anestetizzare profondamente il topo utilizzando una macchina per anestesia per piccoli animali utilizzando isoflurano (3% in ossigeno). Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso di ritiro dell'arto prima di continuare.
Decapitare il topo usando grandi forbici e raffreddare immediatamente la testa in una soluzione di taglio ghiacciata.
Aprire il cranio con un'unica incisione sulla linea mediana da caudale a rostrale e spingere delicatamente i pezzi di cranio ai lati usando una pinza. Rimuovi rapidamente il cervello sollevandolo delicatamente dal cranio usando una piccola spatola arrotondata. Tagliare il cervelletto con il bisturi. Mettere il cervello in una soluzione di taglio ghiacciata.
Per i siti di iniezione della corteccia prefrontale mediale o della mPFC: tagliare la parte anteriore del cervello (contenente mPFC) usando un bisturi e mettere in una soluzione di taglio ghiacciata fino al taglio.
Rimuovere la soluzione di taglio in eccesso con carta da filtro e incollare la parte posteriore del cervello sul tavolino del vibratomo.
Per le fette di amigdala inclinate, incollare il cervello su un blocco di agar (4%) tagliato con un angolo di 35° (Figura 1D, al centro). Per le fette di amigdala coronale, il nucleo genicolato mediale/i siti di iniezione del nucleo talamico intralaminare posteriore (MGm/PIN) e i siti di iniezione di mPFC, incollare il cervello direttamente sul tavolino (Figura 1D, a sinistra e a destra). Posiziona un blocco di agar aggiuntivo dietro il cervello per stabilità durante l'affettatura.
Posizionare il tavolino nella camera di taglio con una soluzione di taglio ossigenata ghiacciata che viene mantenuta a 4 °C utilizzando un'unità di raffreddamento. Preparare fette acute di amigdala (320 μm) utilizzando una lama di zaffiro. Posizionare le fette in una camera di interfaccia alimentata con ACSF ossigenato a temperatura ambiente (RT).
Dopo la preparazione delle fette acute di amigdala, porre la camera di interfaccia in un bagno d'acqua a 36 °C per recuperare le fette per 35 - 45 minuti. Successivamente, riportare la camera di interfaccia su RT.
All'inizio della fase 1.10, tagliare le fette dei siti di iniezione come descritto in precedenza per le fette acute dell'amigdala (fasi 1.8 - 1.9). In questo caso non è necessario il recupero delle fette nel bagnomaria. opzionale: Per stimare rapidamente la posizione del sito di iniezione, osservare le fette su uno stereoscopio dotato di una lampada fluorescente e di set di filtri appropriati.

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Risultati

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Figura 1. Iniezioni stereotassiche, preparazione di fette cerebrali acute e visualizzazione delle fibre presinaptiche.(A, B) Iniezione stereotassica di virus. A) Immagine di topo anestetizzato posizionato in una cornice stereotassica con il cranio esposto e la pipetta per iniezione. Riquadro: Ingrandisci l'immagine della pipetta per iniezione riempita con soluzione virale mescolata c...