Generazione di una fetta di cervello coronale che espone le regioni dell'amigdala da un cervello di topo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Bosch, D., et al. Dissezione optogenetica ex vivo dei circuiti della paura in fette di cervello. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra la preparazione di sottili fette di cervello coronale da un cervello murino, esponendo le regioni dell'amigdala ricche di connessioni sinaptiche dalla corteccia prefrontale mediale. Le fette vengono quindi recuperate nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato per mantenere la vitalità neuronale.

Protocollo

1. Preparazione di fette acute

Preparare ACSF, soluzione di taglio, strumenti (forbici, bisturi, pinze, spatola, pipetta Pasteur) e blocchi di agar.
NOTA: Per ogni esperimento è necessario 1 L di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF). Come precedentemente pubblicato, l'ACSF è preparato sciogliendo sostanze chimiche in H2O a doppia distillazione. La soluzione di taglio viene preparata integrando 200 ml di ACSF con 0,87 ml di soluzione madre 2 M MgSO₄.
Ossigenare ACSF e soluzione di taglio durante l'esperimento con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂.
Anestetizzare profondamente il topo utilizzando una macchina per anestesia per piccoli animali, utilizzando isoflurano (3% di ossigeno). Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso di ritiro dell'arto prima di continuare.
Decapita il topo usando grandi forbici e raffredda immediatamente la testa in una soluzione di taglio ghiacciata.
Apri il cranio con un'unica incisione sulla linea mediana da caudale a rostrale e spingi delicatamente i pezzi del cranio ai lati usando una pinza. Rimuovere rapidamente il cervello sollevandolo delicatamente dal cranio usando una piccola spatola arrotondata. Tagliare il cervelletto con il bisturi. Metti il cervello in una soluzione di taglio ghiacciata.
Per i siti di iniezione della mPFC, utilizzare un bisturi per tagliare la parte anteriore del cervello (contenente mPFC) e metterlo in una soluzione di taglio ghiacciata fino al taglio.
Rimuovere la soluzione di taglio in eccesso con carta da filtro e incollare la parte posteriore del cervello sul tavolino del vibratomo.
Per le fette di amigdala coronale, i siti di iniezione di MGm/PIN e i siti di iniezione di mPFC, incollare il cervello direttamente sul tavolino (Figura 1D, a sinistra e a destra). Posiziona un blocco di agar aggiuntivo dietro il cervello per stabilità durante l'affettatura.
Posizionare il tavolino in una camera di taglio con una soluzione di taglio ossigenata ghiacciata mantenuta a 4 °C utilizzando un'unità di raffreddamento. Usando una lama di zaffiro, preparare fette coronali dell'amigdala. Posizionare le fette in una camera di interfaccia alimentata con ACSF ossigenato a RT.

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Risultati

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Figura 1. Iniezioni stereotassiche, preparazione di fette cerebrali acute e visualizzazione delle fibre presinaptiche. (A, B) Iniezione stereotassica di virus. A) Immagine di un topo anestetizzato posto in una cornice stereotassica con il cranio esposto e la pipetta per iniezione. Riquadro: Ingrandisci l'immagine della pipetta per iniezione riempita con soluzione virale mescolata con...