Una tecnica per isolare nuclei da cellule non neuronali nel giro dentato dell'ippocampo

Abstract

Fonte: Kerloch, T., et al. Nuclei attivati dalla fluorescenza Ordinamento negativo dei neuroni combinato con il sequenziamento dell'RNA di singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo. J. Vis. Exp. (2022).

Il video mostra un metodo per isolare nuclei intatti da cellule gliali e staminali nel giro dentato (DG) dell'ippocampo di topo. Il tessuto DG viene dissociato meccanicamente in un tampone di omogeneizzazione freddo per rilasciare i nuclei. I detriti tissutali e gli altri organelli rilasciati vengono scartati e i nuclei vengono colorati con una colorazione del DNA e un anticorpo coniugato con fluorofori specifico per l'antigene nucleare neuronale (NeuN). Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza viene quindi impiegato per isolare i nuclei NeuN-negativi delle cellule non neuronali.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto

1. Dissezione del DG (Tempo: 15 min)

1. Preparare i terreni di isolamento dei nuclei 1 e 2 (NIM1 e NIM2), il tampone di omogeneizzazione (HB) e i terreni di lavaggio (WM) (Tabella 1). Metti tutti i tamponi, i terreni, i reagenti e gli strumenti sul ghiaccio fino al momento del bisogno. Mettere l'omogeneizzatore Dounce (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio durante la preparazione (minimo 1 ora prima della fase di omogeneizzazione).
   nota:....

Risultati

Figura 1: Preparazione di una sospensione di singoli nuclei dal DG sezionato di topi adulti per snRNA-seq di popolazioni non neuronali. Diagramma di flusso che descrive le fasi principali del protocollo che includono la dissezione del DG di topo, la preparazione di una sospensione di singoli nuclei, l'immunocolorazione NeuN e lo smistamento NeuN-FANS negativo prima di procedere con snRNA-seq.

<.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microprovetta da 0,5 ml	Eppendorf	30124537
10.00μm Microsfere di carbossilato Flouresbrite YG	Poliscienze	15700-10
Provette da centrifuga in polipropilene da 15 mL	Corning	430052
2 paia di pinze sterili Dumont #5	Strumenti di Fine Science	11252-30
4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
Sistema 4150 TapeStation	Agilent	N/A
Provetta da 5 mL in polipropilene ad alta trasparenza a fondo tondo con tappo a scatto	Falco	352063
5 mL provetta in polistirene a fondo tondo con tappo a scatto per filtro cellulare	Falco	352235
Provette da centrifuga in polipropilene da 50 mL	Corning	430829
Filtro cellulare da 70 μm	Falco	352350
8 particelle di calibrazione arcobaleno SPHERO di picco	BD Bioscienze	RCP-30-5A
Perline Accudrop	BD Bioscienze	N/A
Centrifuga Allegra X-30R	Beckman Coulter	N/A
Anticorpo anti-NeuN, clone A60, Alexa Fluor 488 coniugato	Millipore	MAB377X
BD FACSAria Citometro a Flusso di Fusione	BD Bioscienze	N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/A
BSA 7,5%	Gibco	15260037
Ditiotreitolo (DTT)	Termo Scientifico	R0861
Set di smerigliatrici per tessuti: mortaio, pestello sciolto (A) e pestello stretto (B)	KIMBLE	D8938-1SET
Eppendorf Provette Protein LoBind 1.5ml	Eppendorf	30108116
Stop, 100x Inibitore della proteasi	ThermoFisher	78429
KCl	Qualsiasi fornitore di prodotti chimici		Realizzato in laboratorio
LUNA-FX7 Contatore automatico di celle	Logos Biosystems	N/A
MgCl2	Qualsiasi fornitore di prodotti chimici		Realizzato in laboratorio
N°10 bisturi sterili monouso custoditi	Swann-Morton	6601
Acqua priva di nucleasi	Sigma Aldrich	W4502-1L
Paio di forbici chirurgiche sterili per studenti	Strumenti di Fine Science	91401-12
PBS	Qualsiasi fornitore di prodotti chimici		Realizzato in laboratorio
Inibitore della RNasi 40 U μl-1	Ambion	AM2684
RNasina 40 U μl-1	Promega	N211A
Piastra di Petri sterile	Corning	430167
Saccarosio	Sigma Aldrich	59378-500G
Tampone Tris, pH 8,0	Qualsiasi fornitore di prodotti chimici		Realizzato in laboratorio
Triton X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Blu di tripano	Invitrogen	T10282