Una tecnica per isolare nuclei da cellule non neuronali nel giro dentato dell'ippocampo

Abstract

Fonte: Kerloch, T., et al. Nuclei attivati dalla fluorescenza Ordinamento negativo dei neuroni combinato con il sequenziamento dell'RNA di singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo. J. Vis. Exp. (2022).

Il video mostra un metodo per isolare nuclei intatti da cellule gliali e staminali nel giro dentato (DG) dell'ippocampo di topo. Il tessuto DG viene dissociato meccanicamente in un tampone di omogeneizzazione freddo per rilasciare i nuclei. I detriti tissutali e gli altri organelli rilasciati vengono scartati e i nuclei vengono colorati con una colorazione del DNA e un anticorpo coniugato con fluorofori specifico per l'antigene nucleare neuronale (NeuN). Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza viene quindi impiegato per isolare i nuclei NeuN-negativi delle cellule non neuronali.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto

1. Dissezione del DG (Tempo: 15 min)

1. Preparare i terreni di isolamento dei nuclei 1 e 2 (NIM1 e NIM2), il tampone di omogeneizzazione (HB) e i terreni di lavaggio (WM) (Tabella 1). Metti tutti i tamponi, i terreni, i reagenti e gli strumenti sul ghiaccio fino al momento del bisogno. Mettere l'omogeneizzatore Dounce (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio durante la preparazione (minimo 1 ora prima della fase di omogeneizzazione).
   nota: NIM1 può essere preparato e conservato a 4 °C per un massimo di 6 mesi. NIM2, HB e WM dovrebbero essere preparati al momento.
   cautela: Manipolare con cura il ditiotreitolo (DTT), l'inibitore della proteasi e Triton X-100. Questi composti sono irritanti per la pelle e gli occhi, acutamente tossici e pericolosi per l'ambiente acquatico. Durante l'utilizzo di queste sostanze chimiche, indossare guanti, indumenti protettivi, protezioni per gli occhi e il viso, lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione ed evitare il rilascio nell'ambiente.
2. Eutanasia di un topo maschio C57Bl/6J di 22 mesi mediante lussazione cervicale seguendo la procedura Home Office Schedule 1><. nota: Vedi la discussione per il razionale riguardante l'uso di topi di 22 mesi in questo studio. Tuttavia, questo protocollo può essere eseguito a qualsiasi età nel corso della vita.
3. Sezionare il cervello da un topo soppresso e trasferirlo in una capsula di Petri di 10 cm riempita con soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (PBS) (Figura 1). Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio. Rimuovere il cervelletto usando un bisturi e tagliare il cervello a metà tra i due emisferi (lungo l'asse sagittale).
4. Riempi una nuova capsula Petri da 10 cm con PBS ghiacciato e mettila sul ghiaccio. Trasferisci metà del cervello nella nuova capsula di Petri. Usando un binocolo, seziona il DG e ripeti questo passaggio per ottenere il secondo DG dalla seconda metà del cervello><. nota: Questi passaggi (passaggi 1.2-1.4) sono stati adattati da una procedura precedentemente descritta. In questa fase è importante procedere il più rapidamente possibile per preservare l'integrità delle cellule.
5. Trasferire i due DG nell'omogeneizzatore Dounce preraffreddato e aggiungere 1 mL di HB freddo.

2. Dissociazione tissutale, isolamento di singoli nuclei e immunocolorazione anti-NeuN (Tempo: 2 h)

1. Omogeneizzare il tessuto con 10 colpi del pestello "A" sciolto, seguiti da 15 colpi del pestello "B" stretto.
   nota: L'omogeneizzazione a denuffo deve essere eseguita con la malta su ghiaccio con colpi delicati per ridurre il calore causato dall'attrito e dalla formazione di schiuma. Tutti i tamponi e le attrezzature devono essere preraffreddati e mantenuti in ghiaccio durante la procedura.
2. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta prerefrigerata da 15 mL; sciacquare l'omogeneizzatore Dounce con 1 mL di HB freddo e unire nella stessa provetta. Aggiungere 3 mL di HB alla provetta da 15 mL e incubare 5 minuti con ghiaccio. Mescolare 2 volte capovolgendo delicatamente il tubo.
3. Pre-bagnare un tappo del filtro da 70 μm con 0,5 mL di HB su una provetta da 50 mL. Tendere la sospensione dei nuclei dal passaggio 2.2 rovesciando delicatamente la provetta da 15 ml nel filtro cellulare. Lavare il filtro cellulare con 0,5 ml di HB.
4. Rimuovere il filtro cellulare e centrifugare la provetta a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, utilizzando una centrifuga a secchiello oscillante. Scartare il surnatante.
   nota: Filtrare l'omogenato aiuterà a ridurre i detriti, il che è fondamentale per la citometria a flusso e le fasi a valle del sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq).
5. Risospendere delicatamente il pellet in 4 mL di HB utilizzando una pipetta P1000. Incubare con ghiaccio per 5 min. Centrifugare a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 mL di WM.
6. Pre-inumidire un tappo del filtro da 35 μm su una provetta da 15 mL con 0,5 mL di WM. Filtrare la sospensione dei nuclei dal passaggio 2,5 attraverso il filtro cellulare, pipettando delicatamente 0,5 mL alla volta utilizzando una pipetta P1000.
7. Lavare il tappo del filtro con 0,5 ml di WM e posizionare la provetta sul ghiaccio. Trasferire il filtrato in una nuova provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min e 4 °C a 500 x g. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 mL di WM.
8. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di WM con l'antigene nucleare antineuronale di topo (NeuN), l'anticorpo coniugato AlexaFluor 488 (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) e 1 μg/mL di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Incubare per 45 minuti con ghiaccio al buio.
   nota: Per ottimizzare l'immunocolorazione dei nuclei isolati, si consiglia di titolare l'anticorpo per determinare la diluizione ottimale per l'analisi e la selezione della citometria a flusso. Quindi, eseguire controlli adeguati per confermare che le condizioni di colorazione siano ottimali. Ad esempio, con l'anticorpo coniugato anti-NeuN-AF488, sono stati eseguiti un controllo negativo (cioè nessuna aggiunta dell'anticorpo, Figura 2A) e un controllo positivo (cioè colorazione con l'anticorpo, Figura 2B) per valutare la segregazione delle popolazioni non colorate e colorate. Quando si inizia a lavorare con un anticorpo coniugato AF488, si raccomanda di eseguire un controllo dell'isotipo coniugato AF488 per valutare la specificità. Se viene utilizzato un anticorpo non coniugato, potrebbe essere necessario un controllo aggiuntivo, come l'aggiunta di un anticorpo secondario solo a una preparazione di nuclei, per valutare il legame non specifico dell'anticorpo secondario.

3. Ordinamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) per escludere le popolazioni neuronali (Tempo: 45 min)

1. Trasferire la sospensione di nuclei immunocolorati in una provetta da 5 ml e tenerla in ghiaccio fino all'inizio della procedura di citometria a flusso.
   nota: Se si lavora con pezzi di tessuto più grandi di due DG di topo, potrebbe essere necessaria un'ulteriore diluizione con tampone WM per evitare di intasare il selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) se la densità dei nuclei nella soluzione diventa elevata.
2. Agitare i campioni per 3 s a bassa velocità prima di posizionare i tubi nello strumento FACS (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: (Configurazione FACS) All'inizio della procedura le selezionatrici devono essere allineate con le particelle di calibrazione seguendo le raccomandazioni del produttore. Il ritardo di caduta è stato calibrato con perline o microsfere (vedi Tabella dei materiali) secondo il modello FACS. I campioni sono stati selezionati a 4 °C in modalità di purezza. Per ridurre il volume di raccolta, i nuclei sono stati selezionati attraverso un ugello da 70 μm alla pressione consigliata per il citometro a flusso. I nuclei sono stati ordinati in provette da 1,5 mL a basso legame (vedi Tabella dei materiali) contenenti 50 μl di WM. Tutte le provette di raccolta sono state rivestite con PBS + 5% di albumina sierica bovina (BSA) a 4 °C durante la notte per ridurre il rischio che i nuclei si attacchino alle pareti della provetta.
3. Per acquisire i dati da un campione della sospensione dei nuclei colorati, impostare i gate in altezza DAPI e area DAPI in modo da escludere i detriti cellulari e i nuclei aggregati (Figura 3A). Inoltre, separare i singoli nuclei da eventuali aggregati o detriti cellulari colorati con DPI rimanenti impostando i gate nell'area di dispersione lato log (SSC) e nell'area di dispersione in avanti (FSC) (Figura 3B).
4. Impostare i cancelli per l'anti-NeuN-AF488 e l'area FSC, per isolare la popolazione NeuN-AF488-negativa, come mostrato nella Figura 3C.
5. Dopo l'analisi, utilizzando la strategia di gating sopra descritta, selezionare la popolazione NeuN-AF488-negativa in una provetta di raccolta da 1,5 mL riempita con 50 μL di WM.
   nota: Seguendo la strategia di gating sopra descritta e la procedura di dissezione per isolare il DG dal cervello di un topo adulto, si prevede che la popolazione NeuN-AF488-negativa rappresenti ~14% dei singoli nuclei.

Tabella 1: Composizioni di media e buffer utilizzati nello studio.

Terreno di isolamento dei nuclei #1 (NIM1) - conservare fino a 6 mesi a 4 °C
componente	Volume (μL)	Concentrazione finale (mM)
1,5 M Saccarosio	1.833,30	250
1 M KCl	275	25
1 M MgCl2	55	5
1 M di tampone Tris, pH 8,0	110	10
Acqua priva di nucleasi	8.726,70	-
Volume totale	11.000	-
Mezzo di isolamento dei nuclei #2 (NIM2) - fare fresco
componente	Volume (μL)	Concentrazione finale
NIM1	10.769	-
1 mM DTT	11	1 μM
100x Inibitore della proteasi	110	1x
Triton X-100 10% (v/v)	110	0,1% (v/v)
Volume totale	11.000	-
Tampone di omogeneizzazione (HB) - preparare fresco
componente	Volume (μL)	Concentrazione finale
NIM2	10.958,75	-
Inibitore della RNasi, 40 U μL-1	27,5	100 U mL-1
RNasina, 40 U μL-1	Ore 13.75	50 U mL-1
Volume totale	11.000	-
Wash Media (WM)
componente	Volume (μL)	Concentrazione finale
BSA 7,5%	1.466,70	1%
Inibitore della RNasi, 40 U μL-1	27,5	100 U mL-1
RNasina, 40 U μL-1	Ore 13.75	50 U mL-1
Pbs	9.492,05	-
Volume totale	11.000	-

Risultati

Figura 1: Preparazione di una sospensione di singoli nuclei dal DG sezionato di topi adulti per snRNA-seq di popolazioni non neuronali. Diagramma di flusso che descrive le fasi principali del protocollo che includono la dissezione del DG di topo, la preparazione di una sospensione di singoli nuclei, l'immunocolorazione NeuN e lo smistamento NeuN-FANS negativo prima di procedere con snRNA-seq.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microprovetta da 0,5 ml	Eppendorf	30124537
10.00μm Microsfere di carbossilato Flouresbrite YG	Poliscienze	15700-10
Provette da centrifuga in polipropilene da 15 mL	Corning	430052
2 paia di pinze sterili Dumont #5	Strumenti di Fine Science	11252-30
4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
Sistema 4150 TapeStation	Agilent	N/A
Provetta da 5 mL in polipropilene ad alta trasparenza a fondo tondo con tappo a scatto	Falco	352063
5 mL provetta in polistirene a fondo tondo con tappo a scatto per filtro cellulare	Falco	352235
Provette da centrifuga in polipropilene da 50 mL	Corning	430829
Filtro cellulare da 70 μm	Falco	352350
8 particelle di calibrazione arcobaleno SPHERO di picco	BD Bioscienze	RCP-30-5A
Perline Accudrop	BD Bioscienze	N/A
Centrifuga Allegra X-30R	Beckman Coulter	N/A
Anticorpo anti-NeuN, clone A60, Alexa Fluor 488 coniugato	Millipore	MAB377X
BD FACSAria Citometro a Flusso di Fusione	BD Bioscienze	N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/A
BSA 7,5%	Gibco	15260037
Ditiotreitolo (DTT)	Termo Scientifico	R0861
Set di smerigliatrici per tessuti: mortaio, pestello sciolto (A) e pestello stretto (B)	KIMBLE	D8938-1SET
Eppendorf Provette Protein LoBind 1.5ml	Eppendorf	30108116
Stop, 100x Inibitore della proteasi	ThermoFisher	78429
KCl	Qualsiasi fornitore di prodotti chimici		Realizzato in laboratorio
LUNA-FX7 Contatore automatico di celle	Logos Biosystems	N/A
MgCl2	Qualsiasi fornitore di prodotti chimici		Realizzato in laboratorio
N°10 bisturi sterili monouso custoditi	Swann-Morton	6601
Acqua priva di nucleasi	Sigma Aldrich	W4502-1L
Paio di forbici chirurgiche sterili per studenti	Strumenti di Fine Science	91401-12
PBS	Qualsiasi fornitore di prodotti chimici		Realizzato in laboratorio
Inibitore della RNasi 40 U μl-1	Ambion	AM2684
RNasina 40 U μl-1	Promega	N211A
Piastra di Petri sterile	Corning	430167
Saccarosio	Sigma Aldrich	59378-500G
Tampone Tris, pH 8,0	Qualsiasi fornitore di prodotti chimici		Realizzato in laboratorio
Triton X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Blu di tripano	Invitrogen	T10282