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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Materiali
- Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare il protocollo:
- Preparare il tampone di carico aggiungendo siero fetale bovino (FBS, 2%) a soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungi il colorante rosso neutro (NR) (ultimo 1%) al PBS.
- Preparare le seguenti soluzioni utilizzando il kit per la dissociazione cerebrale per adulti disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
- Per preparare la miscela enzimatica 1, pipettare 1,9 mL di tampone Z e 50 μl di enzima P in una provetta da centrifuga da 15 mL.
- Per preparare la miscela enzimatica 2, pipettare 20 μl di tampone Y e 10 μl di enzima A in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Preparare la soluzione per la rimozione dei detriti.
2. Perfusione e dissezione dei topi
- Per via intraperitoneale (i.p.) iniettare nel topo 500 μL di colorante NR all'1% in PBS 2-3 ore prima dell'anestesia.
nota: L'iniezione intraperitoneale di NR in modelli murini demielinizzanti aiuta a discernere le lesioni (Figura 1).
- Anestetizzare il topo con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) e assicurarsi che il topo sia anestetizzato con successo esaminando le risposte al dolore.
- Apri la cavità toracica del topo ed esponi il cuore.
- Tagliare con cura un piccolo angolo dell'atrio destro e perfondere intracardicamente il topo con 20-30 ml di PBS freddo dal ventricolo sinistro.
- Decapitare il topo sotto anestesia.
- Apri il cranio del topo e libera con cura il cervello dal cranio.
- Trasferire il cervello nello stampo a fette di cervello di topo e tagliare il cervello a fette di 0,1 cm.
- Togliete le fette di cervello e mettetele in PBS freddo in una capsula di Petri (60/15 mm). Utilizzando una pinza microchirurgica, sezionare le lesioni marcate con il colorante NR attorno al corpo calloso sotto uno stereomicroscopio><.
nota: Assicurarsi che il tessuto sezionato sia il più completo possibile per facilitare il successivo trasferimento; L'avanzamento totale della dissezione dovrebbe essere completato in 2 ore.
- Trasferire il tessuto sezionato in provette da centrifuga da 15 mL contenenti la quantità appropriata di tampone di caricamento a freddo.
nota: Raggruppare il tessuto del corpo calloso di 2-3 topi in una provetta come un unico campione.
3. Dissociazione tissutale
- Centrifugare il tessuto sezionato a 300 ×g per 30 s (dopo aver raggiunto questa velocità) per raccogliere il campione sul fondo della provetta.
- Preriscaldare la miscela enzimatica 1 e 2 a 37 °C in un incubatore.
- Aggiungere 1.950 μl di miscela enzimatica preriscaldata, 1 a un campione e digerire in un incubatore a 37 °C per 5 minuti.
- Aggiungere 30 μl di miscela enzimatica 2 preriscaldata e mescolare delicatamente.
- Digerire in un'incubatrice a 37 °C per 15 minuti e mescolare delicatamente ogni 5 minuti.
- Aggiungere 4 ml di PBS freddo alla provetta dopo la digestione e agitare delicatamente.
- Posizionare i filtri da 70 μm su provette da centrifuga da 50 mL e prebagnare i filtri con 500 μL di PBS freddo. Filtrare il tessuto dissociato facendo passare i campioni di tessuto digerito attraverso i filtri e trasferire la sospensione filtrata nella provetta da centrifuga da 50 mL in una provetta da centrifuga da 15 mL.
nota: Salta questo passaggio se la quantità di tessuto è troppo piccola.
- Centrifugare i campioni di tessuto filtrato a 300 ×g per 10 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante lentamente e completamente.
nota: Tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio ad eccezione della digestione enzimatica.
4. Rimozione dei detriti
- Risospendere delicatamente il pellet della cella con 1.550 μl di PBS freddo.
- Aggiungere 450 μl di soluzione fredda per la rimozione dei detriti e mescolare bene.
- Sovrapporre la miscela di cui sopra lentamente e delicatamente con 2 x 1 mL di PBS freddo utilizzando una pipetta da 1.000 μl.
nota: Inclinare la provetta da centrifuga di 45° e aggiungere lentamente il PBS lungo la parete della provetta con la pipetta.
- Trasferire la provetta lentamente e delicatamente in una centrifuga e centrifugare a 4 °C e 3.000 × g per 10 minuti.
- Cerca tre strati dopo la centrifugazione. Aspirare completamente i due strati superiori utilizzando una pipetta da 1.000 μl (Figura 2).
- Riempire la provetta fino a 5 mL con tampone di caricamento freddo e capovolgere delicatamente la provetta tre volte.
- Centrifugare a 4 °C e 1.000 × g per 10 minuti. Aspirare completamente il surnatante ed evitare di rompere il pellet cellulare.
5. Separazione magnetica delle cellule microgliali
- Risospendere il pellet cellulare con 90 μL di tampone di caricamento e aggiungere 10 μL di microsfere CD11b (Microglia).
- Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C.
- Aggiungere 1 mL di tampone di caricamento e pipettare delicatamente il liquido su e giù con una pipetta da 1.000 μL per lavare le cellule dopo l'incubazione. Centrifugare le celle a 4 °C e 300 × g per 10 minuti e aspirare completamente il surnatante per rimuovere le perle non legate.
- Risospendere le celle in 500 μL di tampone di caricamento.
- Posizionare la colonna MS con il suo separatore per la selezione positiva nel campo magnetico.
- Sciacquare la colonna con 500 μL di tampone di caricamento per proteggere le celle e garantire l'efficienza della selezione magnetica, seguendo il protocollo del produttore.
- Applicare la sospensione cellulare sulla colonna MS ed eliminare il flusso contenente cellule non marcate.
- Aggiungere tre volte 500 μl di tampone di carico alla colonna per lavare via le cellule che aderiscono alla parete della colonna ed eliminare il flusso.
nota: Aggiungere un nuovo buffer di carico per il lavaggio solo quando il serbatoio della colonna è vuoto.
- Rimuovere la colonna dal separatore dopo averla lavata e posizionarla su una provetta da centrifuga da 15 mL.
- Aggiungere 1 mL di tampone di caricamento nella colonna e spingere lo stantuffo verso il basso per eliminare le celle marcate magneticamente. Ripetere questo passaggio tre volte per raccogliere completamente le celle marcate magneticamente.
