Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione della Soluzione
- Piastre NGM-Agar (1 L)
- Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di terreno peptonico (ad es. Bacto-Peptone) e 20 g di agar. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in stock di etanolo al 95% [EtOH]), 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 25 mL di 1 M K2PO4 e 1 mL di amfotericina B (2,5 mg/mL stock).
- Piastre NGM-Agar RNAi (1 L)
- Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone e 20 g di agar. Dopo la sterilizzazione in autoclave aggiungere 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in stock EtOH al 95%), 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 25 mL di 1 M K2PO4, 1 mL di amfotericina B (2,5 mg/mL stock), 1 mL di 1 M isopropil β-d-1-tiogalactopiranoside (IPTG) e 1 mL di carbenicillina (50 mg/mL).
- Luria-Bertani (LB)-Agar (1 L)
- Aggiungere 10 g di terreno peptonico, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl, 20 g di agar, 10 mL di 1 M Tris pH 8.0. Aggiungere H2O a 1 L. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di 50 mg/mL di carbenicillina e 2,5 mL di 5 mg/mL di tetraciclina.
- LB Medio (1 L)
- Aggiungere 10 g di terreno peptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl e 10 ml di 1 M Tris pH 8.0. Aggiungere H2O a 1 L. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di 50 mg/mL di carbenicillina.
- Tampone M9 (1 L)
- Aggiungere 6,0 g di Na2HPO4, 3 g di K2PO4, 5 g di NaCl e 50 mg di gelatina. Prima dell'uso, aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4.
- Soluzione sbiancante (10 mL)
- Aggiungere 1 mL di NaClO e 2 mL di 5 N NaOH. Aggiungere H2O a 10 mL.
2. Preparazione delle piastre RNAi
Nota: C. elegans viene tipicamente coltivato in laboratorio su piastre di Petri da 6 cm contenenti 7,5 ml di Nago Medium Agar (NGM-Agar). Questo protocollo è ottimizzato per i vermi mantenuti a 15 °C. Per preparare le piastre con NGM, utilizzare tecniche sterili standard per prevenire la contaminazione fungina e batterica. Quello che segue è il protocollo per preparare piastre NGM integrate con reagenti per RNAi.
- Preparare piastre NGM-Agar RNAi da 6 cm contenenti 1 mM di IPTG e 50 μg/mL di carbenicillina. Lasciateli asciugare per 24 – 48 ore a temperatura ambiente al buio.
- Mantenere le piastre RNAi a 4 °C al buio. Non utilizzare se più vecchio di 14 giorni.
- Selezionare il clone di batteri RNAi (Escherichia coli HT115) contenente il plasmide L4440 con la sequenza di DNA del gene lin-53 dallo stock di glicerolo congelato dalla libreria RNAi disponibile13 su piastre LB-agar contenenti 50 μg/mL di carbenicillina e 12,5 μg/mL di tetraciclina utilizzando il pattern di striature trifase. Far crescere i batteri a 37 °C per una notte. Questo clone consente la produzione IPTG-dipendente di lin-53 dsRNA nei batteri.
- Inoltre, coltiva batteri RNAi che contengono il plasmide L4440 senza alcuna sequenza genica come controllo del vettore vuoto.
- Il giorno successivo, prelevare una singola colonia da piastre di lin-53 o di agar vettoriale vuoto utilizzando un puntale per pipetta da 200 μL e inoculare ciascuna di esse in una provetta di coltura separata contenente 2 mL di terreno LB liquido integrato con 50 μg/mL di carbenicillina. Coltivare le colture durante la notte a 37 °C fino a raggiungere una densità ottica (OD) a 600 nm di 0,6 – 0,8. Misurare il diametro esterno utilizzando uno spettrofotometro.
ATTENZIONE: Il terreno LB liquido non deve contenere tetraciclina a differenza della piastra LB-agar utilizzata per eliminare i batteri dallo stock di glicerolo, poiché l'inclusione di tetraciclina durante l'alimentazione porta a una diminuzione dell'efficienza dell'RNAi.
- Aggiungere 500 μl di ciascuna coltura batterica (lin-53 o vettore vuoto) a piastre NGM-Agar RNAi da 6 cm utilizzando una multipipetta. Incubare le piastre con il coperchio chiuso per una notte a temperatura ambiente al buio per asciugarle. Durante questo periodo, l'IPTG nelle piastre NGM indurrà la produzione di dsRNA nei batteri.
- Utilizzare almeno 3 piastre per coltura batterica per esperimento. Questo fornirà 3 repliche tecniche per ogni esperimento.
- Conservare al buio le piastre NGM-agar RNAi essiccate con batteri a 4 °C per un massimo di due settimane.
3. Preparazione del ceppo C. elegans BAT28
- Mantenere il ceppo di verme BAT288 contenente i transgeni otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] e ntIs1 [gcy-5prom::gfp] sui batteri OP50 utilizzando piastre standard NGM-Agar a 15 °C.
Nota: Per un protocollo dettagliato sulla coltura dei nematodi, vedere. Il rol-6 (su1006) è un allele dominante e un marcatore di iniezione fenotipico comunemente usato16 che provoca il tipico movimento di rotolamento. Viene utilizzato nel transgene otIs305 per tracciare hsp-16.2prom::che-1.
- Mantenere il ceppo BAT28 a 15 °C in ogni momento per prevenire l'attivazione precauzionale del transgene hsp-16.2prom::che-1. Ridurre l'esposizione a temperature superiori a 15 °C gestendo il più possibile lo sforzo.
- Per sincronizzare l'età dei vermi, utilizzare la tecnica dello sbiancamento.
- Lavare le piastre NGM-Agar da 6 cm contenenti adulti e uova di BAT28 utilizzando 900 μL di tampone M9. Pellet di vermi mediante centrifugazione a 900 x g per 1 min. Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 0,5 – 1 ml di soluzione sbiancante e agitare la provetta per circa 1 minuto fino a quando i vermi adulti iniziano ad aprirsi. Monitorare utilizzando uno stereomicroscopio standard.
- Pellet i vermi centrifugando a 900 x g per 1 min. Rimuovere il surnatante.
- Lavare il pellet di vite senza fine 3 volte aggiungendo 800 μl di tampone M9 e centrifugando a 900 x g.
- Mettere le uova pulite su piastre NGM fresche seminate con batteri OP50. Far crescere una popolazione sbiancata su batteri OP50 a 15 °C fino a raggiungere lo stadio L4 (circa 4 giorni). Le larve L4 possono essere riconosciute da una macchia bianca a circa metà strada lungo il lato ventrale del verme18 utilizzando uno stereomicroscopio standard.
nota: Per ottenere il fenotipo di conversione da cellula germinale a neurone dopo la deplezione di lin-53, è necessario che sia esaurito nella generazione parentale (P0). Il punteggio per il fenotipo di conversione viene effettuato nella generazione successiva (generazione filiale F1). Per ottenere l'esaurimento di lin-53 già nel P0, gli animali L4 sono sottoposti a RNAi.
- Trasferire manualmente 50 vermi dello stadio L4 per replica utilizzando un filo di platino su una piastra NGM che non contenga batteri e lasciare che i vermi si allontanino da qualsiasi batterio OP50 trasferito. Lasciare che i vermi si muovano sul piatto per circa 5 minuti. Utilizzare i batteri delle piastre NGM-Agar RNAi precedentemente seminate con batteri RNAi lin-53 (o controllo del vettore vuoto) per trasferire alle rispettive piastre RNAi.
- Evitare di trasferire i batteri OP50 alle piastre RNAi effettive. Lavorare velocemente per ridurre al minimo il tempo di esposizione della deformazione a temperature superiori a 15 °C.
- Incubare i vermi su piastre NGM-Agar RNAi a 15 °C per circa 7 giorni fino a quando la progenie F1 dei vermi raggiunge lo stadio L3 – L4. Possono essere chiaramente separati dagli animali P0 poiché sono più grandi e più spessi della progenie F1.
- Controllare visivamente con uno stereomicroscopio standard se i vermi progenie F1 mostrano il fenotipo della vulva sporgente (pvul) come mostrato nella Figura 1. L'RNAi contro la lin-53 ha effetti pleiotropici e provoca il fenotipo pvul che può essere utilizzato per valutare se l'RNAi contro la lin-53 ha avuto successo.
nota: L'RNAi contro il lin-53 può anche causare letalità degli embrioni F1. Questo effetto aumenta se le piastre vengono esposte a gradi superiori a 15 °C prima che gli animali raggiungano lo stadio L3 – L4. Gli embrioni morti possono essere riconosciuti dall'arresto dello sviluppo e dalla mancanza di schiusa.
- Incubare le piastre al buio poiché l'IPTG è sensibile alla luce.
4. Induzione della Riprogrammazione delle Cellule Germinali
- Incubare le piastre RNAi esaminate contenenti lin-53 e progenie F1 trattata con RNAi a vettore vuoto per 30 minuti a 37 °C al buio per attivare CHE-1. Utilizzare un'incubatrice ventilata poiché consente uno shock termico più efficiente.
- Lasciare che gli animali sottoposti a shock termico si riprendano per 30 minuti a temperatura ambiente al buio e poi incubare le piastre a 25 °C per una notte al buio.
- Utilizzando uno stereomicroscopio standard accoppiato a una sorgente di luce a fluorescenza, esaminare gli animali sotto il filtro della proteina fluorescente verde (GFP) per i segnali derivati da gcy-5prom::gfp nell'area centrale del corpo dei vermi, come mostrato nella Figura 2. Microscopio impostato per segnali GFP: massima eccitazione a 488 nm con emissione massima a 509 nm.
- Valutare il grado di conversione da cellula germinale a neurone montando animali con segnali GFP nell'area centrale del corpo su vetrini per microscopia contenenti pad agar.
- Conta il numero di animali che mostrano la conversione da cellula germinale a neurone rispetto agli animali scuri per valutare la penetranza del fenotipo. Tipicamente, circa il 30% degli animali mostra segnali GFP discreti nella linea germinale dopo la deplezione di lin-53, mentre non più del 5% degli animali mostra segnali GFP diffusi nella linea germinale su RNAi vettore vuoto.
