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Disclaimer: Tutte le procedure che coinvolgono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Omogeneizzazione meccanica del cervello e del midollo spinale
NOTA: I volumi descritti in questa sezione sono sufficienti per l'omogeneizzazione di metà cervello o midollo spinale.
- Pre-raffreddare il mortaio di vetro del macinatore di tessuti Dounce (Tabella dei materiali) messo in ghiaccio.
- Aggiungere 3 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) pre-raffreddata alla malta.
- Trasferisci il tessuto (cervello o midollo spinale) dal pozzetto della piastra a 6 pozzetti nella malta di vetro, assicurandoti che sia immerso in 1x HBSS e si trovi sul fondo della malta.
- Schiacciare delicatamente il tessuto con 10 colpi di pestello A seguiti da 10 colpi di pestello B. Trasferire la miscela omogeneizzata in una nuova provetta conica da 15 mL.
- Riempire la provetta fino a un volume finale di 10 mL utilizzando 1x HBSS pre-raffreddato e centrifugare per 10 minuti a 320 x g a 4 °C.
- Aspirare il surnatante e aggiungere 1x HBSS ghiacciato a ciascuna provetta fino a un volume finale di 7 mL e risospendere delicatamente il pellet mediante vortex.
2. Rimozione dei detriti
NOTA: La rimozione dei detriti, composti principalmente da tessuto non digerito e guaine mieliniche, è un passaggio critico per consentire una colorazione efficiente dell'omogeneizzato di tessuto per le successive analisi citofluorimetriche.
- Filtrare ogni campione attraverso un colino cellulare da 70 μm per rimuovere eventuali pezzi di tessuto non digeriti. Questo passaggio è particolarmente importante quando si lavora con i tessuti del midollo spinale, poiché è più probabile che questi campioni contengano frammenti nervosi non digeriti o meningi che potrebbero influenzare i passaggi successivi.
- Assicurarsi che il volume finale sia di 7 mL in ciascuna provetta del campione. In caso contrario, riempire con 1x HBSS ghiacciato fino a 7 ml.
- Aggiungere 3 mL di soluzione isotonica di Percoll (IPS) pre-refrigerata a ciascun campione per ottenere un volume finale di 10 mL di una soluzione contenente un mezzo di gradiente di densità a una concentrazione finale del 30%. Agitare delicatamente i campioni per assicurarsi che siano miscelati in modo omogeneo.
- Centrifugare i campioni per 15 minuti a 700 x g a 18 °C, assicurandosi di impostare l'accelerazione della centrifuga su 7 e il freno su 0,
nota: La centrifugazione dovrebbe durare circa 30 minuti.
- Rimuovere delicatamente i campioni dalla centrifuga.
nota: Un disco biancastro composto da detriti e mielina dovrebbe essere visibile galleggiare sulla superficie della soluzione. Un pellet (contenente le celle di interesse) dovrebbe essere visibile sul fondo del tubo.
- Aspirare con cura tutto il disco biancastro di detriti e poi il resto del surnatante, facendo attenzione a non rimuovere il pellet. Lasciare circa 100 μL di soluzione sopra il pellet della cella per evitare il rischio di spostarlo inavvertitamente.
- Aggiungere 1 mL di soluzione bloccante (BL) per citometria a flusso (FACS), risospendere il pellet pipettandolo su e giù con un puntale per pipetta da 1000 μL e trasferire i campioni in provette da 1,5 mL.
- Centrifugare per 5 minuti a 450 x g a temperatura ambiente (RT).
- Aspirare delicatamente il surnatante e risospendere il pellet nell'apposito tampone compatibile con le analisi a valle