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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei materiali
- Tampone di selezione cellulare attivata magneticamente (MACS): preparare 2 mM di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) e albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% (Tabella dei materiali) in PBS-/-.
- Soluzione madre di collagenasi IV (20 U/μL): risospendere la polvere in PBS+/+ (Tabella dei materiali), aliquotare e conservare a -20 °C.
nota: La collagenasi IV richiede che MgCl2 sia completamente attiva; non congelare-scongelare la soluzione di Collagenasi IV.
- Soluzione anestetica-analgesica: miscelare 150 μl di ketamina (150 mg/kg), 25 μl di xilazina (5 mg/kg) e 330 μl di buprecare (0,1 mg/kg) in 1 mL di PBS-/-.
nota: Preparare la soluzione anestetico-analgesica in modo estemporaneo e non conservarla più di un giorno.
- Soluzione di eparina (100 U/mL): Risospendere la polvere in PBS-/-.
- Preparare il sistema di inserimento dell'infusione che collega un tubo a un decanter Erlenmeyer riempito con PBS-/-. Collegare un ago da 23 G all'estremità del tubo di infusione. Aprire l'inserto per infusione e lasciare scorrere il PBS fino a quando non ci sono bolle nel tubo.
- Preparare la lente di ingrandimento binoculare dotata di luce.
2. Alloggiamento dei mouse C57BL/6
- Per l'analisi delle cellule mieloidi o T (PLI coroidei) (PLI coroidei), utilizzare quattro topi per ciascuno e raggruppare i quattro CP (due da ciascun ventricolo laterale, il terzo ventricolo e il quarto ventricolo CP; per otto topi in totale). Non mettere in comune la CP comporta il rischio di non riuscire a rilevare le rare popolazioni immunitarie nella CP a causa della loro bassa abbondanza.
- Lascia che i topi si acclimatino per almeno 7 giorni prima di qualsiasi esperimento. Mantenere i topi in condizioni prive di agenti patogeni a temperatura e umidità costanti, in un ciclo luce/buio di 12/12 h o 14/10 h, con acqua e pellet di cibo standard ad libitum.
3. Perfusione PBS e dissezione cerebrale
- Pesare ciascun topo e iniettare 10 μL/g della soluzione di miscela anestetico-analgesica (fase 1.3) per via intraperitoneale.
- Attendere circa 30 minuti per un'analgesia efficace (controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita del topo).
- Posizionare il topo anestetizzato sulla schiena sul supporto di dissezione e fissare i palmi delle mani al supporto di dissezione.
- Pizzicando la pelle dell'animale con una pinza e usando le forbici, apri l'addome, il diaframma e il torace per esporre il cuore><.
nota: Quando il torace viene aperto, il cervello diventa anossico. Si deve procedere con precisione e rapidità attraverso le fasi successive della perfusione.
- Iniettare 20 μL di soluzione di eparina 100 U/mL direttamente nel ventricolo sinistro.
- Con le forbici sottili, praticare un'incisione di almeno 3 mm nell'atrio destro per consentire al sangue di fuoriuscire dal corpo.
- Subito dopo, inserire l'ago da 23 G posizionato all'estremità del tubo di infusione attraverso la punta del ventricolo sinistro.
- Aprire al massimo il sistema di infusione e attendere la completa perfusione: utilizzando un ago da 23 G ad una portata di circa 6 mL/min, la perfusione è completa in 3 min.
nota: Lo scolorimento uniforme di organi come il fegato attesta l'efficacia della perfusione.
- Chiudere il sistema di infusione e rimuovere l'ago dal ventricolo cardiaco.
- Rimuovi il nastro dai palmi delle mani del mouse. Posizionare il mouse in posizione ventrale.
- Pizzicando la pelle dell'animale con una pinza e usando le forbici, rimuovere la pelle dalla parte superiore della testa, dagli occhi alle orecchie.
- Con l'aiuto delle forbici, taglia il cranio prima tra gli occhi e poi lateralmente da ciascun occhio al midollo spinale appena sopra i muscoli masseteri. Per questo, usa l'estremità delle forbici e procedi delicatamente per evitare di danneggiare il cervello con le forbici.
- Apri il cranio con una pinza pizzicandolo dall'estremità tra gli occhi.
- Usa le forbici per tagliare il midollo spinale ed estrarre il cervello con una pinza, posizionando le loro due punte sul lato laterale del cervello per inclinarlo e metterlo in una capsula di Petri riempita con PBS+/+ ghiacciato. I CP vengono quindi immediatamente raccolti.
nota: Verificare la presenza di scolorimento del cervello per verificare l'efficacia della perfusione.
4. Dissezione del plesso coroideo dal cervello
- Posizionare il lato dorsale del cervello verso l'alto nella capsula di Petri e sotto gli obiettivi degli occhialini binoculari.
- Con l'aiuto di una pinza per mantenere il cervello in posizione, inserire le due estremità di un'altra pinza attraverso la linea mediana tra gli emisferi.
- Usa la pinza per allontanare la corteccia con il callo e l'ippocampo dal setto, esponendo il ventricolo laterale e una parte del terzo ventricolo.
- Identificare la CP laterale come un lungo velo che riveste il ventricolo laterale e che si allarga ad entrambe le estremità. Usa le due estremità di una pinza sottile per afferrare il CP laterale. Fai attenzione a raccogliere la parte posteriore triangolare che potrebbe essere nascosta dalla piega posteriore dell'ippocampo.
- Allontanare la corteccia, il corpo calloso e l'ippocampo dell'emisfero controlaterale dal setto per esporre l'intero terzo ventricolo e il ventricolo laterale opposto.
- Raccogli il terzo CP con una pinza fine, che può essere identificata come una struttura corta con un aspetto superficiale granulare.
- Raccogli l'altro CP laterale.
- Inserisci le due estremità di una pinza tra il cervelletto e il mesencefalo. Staccare il cervelletto dal ponte e dal midollo per esporre il quarto ventricolo.
- Identificare la quarta CP come una lunga struttura globulare con un aspetto superficiale granulare che riveste il quarto ventricolo dall'estremità laterale destra all'estremità sinistra tra il cervelletto e il midollo. Raccogli il quarto CP con una pinza fine.
nota: Il rivestimento a base di silano delle pinze può prevenire l'appiccicosità della CP sulle pinze.
- Ripetere i passaggi 3.1-4.9 per ciascuno degli altri sette topi. Nel frattempo, il CP raccolto può essere conservato temporaneamente in una provetta posta sul ghiaccio.
5. Preparazione dei campioni per l'analisi della citometria a flusso
- Riempire la provetta contenente tutti i CP sezionati fino a 750 μl di PBS+/+.
nota: La deposizione di CP sezionato con una pinza sottile nel tubo produce un piccolo volume di PBS+/+. Per evitare una possibile perdita del tessuto CP, è meglio completare il volume esistente a 750 μL piuttosto che rimuoverlo e sostituirlo con 750 μL freschi di PBS+/+.
- Aggiungere 15 μL di soluzione madre di 20 U/μL di collagenasi IV (vedere la fase 1.2) per una concentrazione finale di 400 U/mL.
nota: La DNAsi I (150 μg/mL) può prevenire l'eccessivo aggregazione cellulare.
- Incubare CP con collagenasi IV a 37 °C in leggera agitazione (300 giri/min) per 45 minuti.
- Pipettare delicatamente su e giù circa 10 volte per finalizzare la dissociazione CP.
- Riempire la provetta CP fino a 1,5 ml con tampone MACS (vedere il passaggio 1.1 della ricetta) per arrestare l'attività della collagenasi IV.
nota: L'attività della collagenasi IV viene interrotta a basse temperature e inibita dall'albumina sierica.
- Centrifugare le cellule a 500 x g, per 5 minuti, a 4 °C. Scartare il surnatante e lavare le cellule con 1,5 mL di tampone MACS.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti, a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 220 μl di tampone MACS.